PETEOS: новый метод для изучения промежуточных продуктов трансляции в клетках
Ученые из Токийского технологического института разработали метод PETEOS, позволяющий улавливать и анализировать pep-tRNA — промежуточные продукты синтеза белка, представляющие собой растущую полипептидную цепь, ковалентно связанную с транспортной РНК внутри рибосомы.
Проблема существующих методов
Изучение pep-tRNA, которые обладают свойствами и РНК, и белка, важно для понимания регуляции трансляции. Однако существующие методы имеют ограничения:
- Рибосомный профилинг не захватывает pep-tRNA, требует много времени и ресурсов.
- Протеомные подходы с использованием LC-MS/MS и нестандартных аминокислот для мечения не нацелены напрямую на pep-tRNA и не отражают статус элонгации трансляции.
Суть метода PETEOS
PETEOS — это не-мечащая методология, которая специфически обогащает и быстро захватывает pep-tRNAs, дополняя обычные платформы анализа транслятома. Процесс состоит из четырех этапов:
- Обогащение РНК с помощью экстракции органическим растворителем и выделение на силикатной колонке.
- Отделение целевых полипептидов от рибонуклеотидов в выделенных pep-tRNA с помощью комбинации высокого pH и температуры.
- Ферментативное переваривание и расщепление освобожденных полипептидов.
- Идентификация полипептидов с помощью шотган-протеомики LC-MS/MS.
Результаты и возможности
- В качестве доказательства концепции метод идентифицировал почти 800 белков E. coli, происходящих из pep-tRNA. Эти белки были обогащены N-концами, что подтверждает захват именно промежуточного пула pep-tRNA.
- PETEOS способен делать "снимки" насинтезома (пула nascent pep-tRNA) в ответ на стресс, например, тепловой шок или обработку антибиотиками. Метод превзошел обычные подходы по способности улавливать острую экспрессию белка при тепловом стрессе и перестройку насинтезома под действием антибиотиков.
Ограничения и перспективы
Метод имеет некоторые ограничения: сложность анализа низкоабундантных pep-tRNA с помощью LC-MS/MS, ограниченная количественная способность из-за стадии с кислым фенолом/хлороформом, отсутствие разрешения на уровне кодонов и сложность захвата C-конца растущего полипептида.
Несмотря на это, метод обладает большим потенциалом для оптимизации. Как отмечает профессор Хидэки Тагути: "PETEOS позволяет проводить анализы, которые недоступны для текущих методов исследования транслятома. Что наиболее важно, он может быть применен к любому организму".