Новые стратегии оптимизации специфичности нуклеаз для редактирования генов
Компания Sangamo Therapeutics, Inc. опубликовала в Nature Biotechnology исследование, описывающее две новые стратегии для оптимизации специфичности редактирования генома с помощью нуклеаз с цинковыми пальцами (ZFN). Это ключевой фактор безопасности для терапевтического применения.
Стратегии направлены на две функциональные области ZFN:
- Настройка аффинности связывания массива цинковых пальцев, распознающего ДНК.
- Замедление каталитической скорости домена расщепления Fok1.
Эти комплементарные подходы можно комбинировать для достижения почти 100% редактирования по цели без детектируемой активности вне цели.
«С этими новыми стратегиями высокая эффективность редактирования полностью сохранилась, а активность вне цели снизилась примерно в 1000 раз, ниже уровня обнаружения», — отметил Эдвард Ребар, технический директор Sangamo.
Ключевые результаты исследования:
- Настройка аффинности: Замена дискретного положительно заряженного остатка в структуре цинкового пальца позволила настроить аффинность ZFN в оптимально специфичный диапазон без потери эффективности.
- Замедление катализа: Скрининг одноаминокислотных замен в домене Fok1 выявил мутации, повышающие специфичность более чем в 1000 раз, давая ZFN больше времени для диссоциации с нецелевых сайтов.
- Терапевтический пример: Применение стратегий для нацеливания на эндогенный ген TCR-альфа в T-клетках привело к эффективности нокаута >98% по цели при недетектируемой активности вне цели (фоновый уровень анализа ~0.01%).
Эти улучшения специфичности платформы ZFN могут позволить создавать нуклеазы для высокоэффективного редактирования с минимальной или отсутствующей активностью вне цели.