Улучшенный способ измерения выживаемости клеток
Измерение токсического воздействия химических соединений на разные типы клеток критически важно для разработки противораковых препаратов, которые должны уничтожать клетки-мишени. Анализ выживаемости клеток также важен в таких областях, как экологический контроль, для проверки промышленных и сельскохозяйственных химикатов на возможное вредное воздействие на здоровые клетки.
Биоинженеры MIT разработали новый тест на токсичность, который измеряет влияние химических веществ на выживаемость клеток с гораздо большей чувствительностью, чем некоторые из самых популярных современных тестов. Он также намного быстрее «золотого стандарта» — теста, который не получил широкого распространения, так как требует 2–3 недели для получения результата. Новый тест может помочь фармацевтическим компаниям и академическим исследователям быстрее выявлять и оценивать новые препараты.
«Тесты на цитотоксичность — одни из наиболее часто используемых в науках о жизни», — говорит Бевин Энгелвард, профессор биологической инженерии MIT и старший автор исследования.
Ведущий автор статьи, опубликованной 5 февраля в Cell Reports, — Ле Нго, бывший аспирант и постдок MIT. Среди других авторов — Цзе Кхи Чан, бывший аспирант Сингапурско-Массачусетского альянса исследований и технологий (SMART); Цзин Ге, бывший аспирант MIT; и Леона Самсон, со-руководитель Нго и заслуженный профессор биологической инженерии MIT.
Измерение выживаемости
Традиционный тест на выживаемость клеток, известный как тест колониеобразования, включает выращивание колоний клеток в чашках для культивирования тканей в течение 2–3 недель после воздействия на клетки химического соединения или другого вредного агента, например, радиации. Затем исследователь подсчитывает количество колоний, чтобы определить, как лечение повлияло на выживаемость клеток.
Часть мотивации Энгелвард для этого исследования — воспоминания о долгих часах подсчета таких колоний в аспирантуре.
«Подсчет действительно трудоемкий и мучительно сложный, потому что вам постоянно приходится решать, что является колонией, а что — дебрисом», — говорит она. «Мало кто сейчас использует тест колониеобразования, потому что он сложный, слишком медленный и требует огромного количества среды для роста клеток, а значит, и много тестируемого соединения».
В последние годы ученые начали использовать другие методы, которые быстрее, но не так точны и чувствительны, как тест колониеобразования. Эти тесты не измеряют рост клеток напрямую, а анализируют функцию митохондрий.
Энгелвард и коллеги поставили задачу разработать тест, который давал бы результаты всего за несколько дней, сохраняя точность и чувствительность теста колониеобразования. Созданная ими система, названная MicroColonyChip, состоит из крошечных лунок на пластине. Обработанные и необработанные клетки помещаются в эти лунки и начинают образовывать очень маленькие колонии в виде сетки. Уже через несколько дней, еще до того, как колонии становятся видны невооруженным глазом, исследователи могут с помощью микроскопа визуализировать ДНК клеток, помеченную флуоресцентным красителем.
Модифицировав код, изначально разработанный бывшим постдоком MIT Дэвидом Вудом и профессором MIT Сангитой Бхатиа, исследователи создали программу, которая измеряет количество флуоресцентной ДНК в каждой лунке и затем вычисляет, какой рост клеток произошел. Сравнивая рост обработанных и необработанных клеток, исследователи могут определить токсичность изучаемого соединения.
«У нас есть автоматическая система сканирования для флуоресцентной визуализации, а последующий анализ изображений полностью автоматизирован», — говорит Нго.
Исследователи сравнили свой новый тест с «золотым стандартом» — тестом колониеобразования — и обнаружили, что результаты неразличимы. Они также смогли точно воспроизвести данные о влиянии гамма-излучения на человеческие лимфобластоидные клетки, собранные 20 лет назад с помощью теста колониеобразования. Используя MicroColonyChip, исследователи получили свои данные за 3 дня вместо 3 недель.
«Мы смогли воспроизвести радиологические исследования 20-летней давности, используя гораздо более простой процесс, чем тот, что применяли они», — говорит Энгелвард.
Большая чувствительность
Исследователи также сравнили свой новый тест с двумя наиболее часто используемыми тестами на токсичность — XTT и CellTiter-Glo (CTG). Оба этих теста являются косвенными измерениями жизнеспособности клеток: XTT измеряет способность клеток расщеплять тетразолий, ключевой этап клеточного метаболизма, а CTG измеряет внутриклеточный уровень АТФ — молекул, которые клетки используют для хранения энергии.
«MicroColonyChip гораздо чувствительнее теста XTT, что действительно позволяет увидеть тонкие изменения в выживаемости клеток, и он так же чувствителен, как тест CTG, но при этом менее подвержен артефактам», — говорит Энгелвард.
Используя новый тест, исследователи изучили эффекты двух повреждающих ДНК препаратов для химиотерапии и обнаружили, что могут точно воспроизвести результаты, полученные с помощью традиционного теста колониеобразования. «Теперь мы планируем расширить эти исследования в надежде продемонстрировать, что тест работает для многих других типов препаратов и клеток», — говорит Нго.
Помимо применения в разработке лекарств, этот тест может быть полезен агентствам по охране окружающей среды, ответственным за проверку химических соединений на потенциальный вред, отмечает Энгелвард. Еще одно возможное применение — персонализированная медицина, где его можно использовать для тестирования различных препаратов на клетках пациента перед выбором лечения.