Нанотомография мембран живых клеток: безметочная эванесцентная микроскопия позволяет отслеживать процессы в реальном времени
Мембраны играют ключевую роль во многих клеточных механизмах, включая интернализацию, адгезию и подвижность. Для их оптической визуализации необходимы специальные конфигурации, чтобы убрать свет из внутренней части клетки.
Французские учёные продемонстрировали, что эванесцентная микроскопия через объектив (epi-EM) — мощный метод для визуализации мембран в живых клетках без использования меток.
Метод и реализация
Команда под руководством Пьера Бона выбрала конфигурацию epi-EM, которая позволила провести сверхаксиально разрешённую томографическую реконструкцию базальной мембраны немеченых живых клеток.
- Для реализации потребовалась простая схема освещения/сбора на стандартном инвертированном микроскопе.
- Необходимы только объектив с высокой апертурой (NAobj > 1.33) и пространственный фильтр в плече эпи-освещения.
Точность и применение
Наноаксиальную томографию применили для получения количественной информации о динамике инвагинаций мембран живых клеток.
- На основе модели многослойного френелевского отражения удалось определить расстояние мембрана/интерфейс с точностью 10 нм.
- Исследовали карту высоты мембраны живых клеток (Wt HEK-293) в течение 15 минут со скоростью 1 кадр в секунду, не нарушая образец.
Преимущества техники
- Легко получить сверхразрешённые по оси Z изображения немеченых образцов при минимальной модификации микроскопа.
- Латеральное разрешение как минимум вдвое выше, чем у классической TIRM.
- Длительность исследования не ограничена, так как уровень сигнала не зависит от стабильности флуорофора.
- Фототоксичность очень низкая, поскольку образец почти не поглощает свет.
Учёные уверены, что эта техника будет полезна для изучения подвижности и адгезии клеток, когда образец нельзя модифицировать (например, стволовые клетки) или требуются очень быстрые и/или длительные наблюдения.