Новый инструмент для наблюдения за работой ферментов на уровне одной молекулы
Ученые из Вашингтонского университета и компании Illumina создали инновационный инструмент для прямого детектирования тонких одно-молекулярных взаимодействий между ДНК и ферментативными белками. Их подход предоставляет новую платформу для наблюдения и записи этих наномасштабных взаимодействий в реальном времени. Как сообщается 28 сентября в Nature Biotechnology, этот инструмент позволит быстро и надежно характеризовать различные механизмы, которые клеточные белки используют для связывания с цепями ДНК. Эта информация может пролить новый свет на атомарные взаимодействия внутри клеток и помочь в разработке новых лекарств против патогенов, нацеленных на ферменты, взаимодействующие с ДНК.
"Существуют и другие одно-молекулярные инструменты, но наш новый инструмент гораздо чувствительнее", — говорит старший автор, профессор физики UW Йенс Гундлах. — "Мы действительно можем улавливать атомарные движения, которые белок передает ДНК".
Инструмент — одно-молекулярные пьезометровые нанопоровые щипцы (single-molecule picometer-resolution nanopore tweezers, SPRNT) — был разработан в ходе работы над смежным проектом.
Команда UW исследовала нанопоровую технологию для быстрого считывания последовательностей ДНК. В их подходе измеряется электрический ток через биологическую пору MspA, встроенную в модифицированную клеточную мембрану. Когда ДНК проходит через крошечное отверстие в поре шириной всего 0.00000012 см (1/10 000 толщины человеческого волоса), ток меняется в зависимости от последовательности "букв" ДНК. Эти изменения тока используются для определения последовательностей.
В процессе исследования нанопорового секвенирования команда опробовала различные молекулярные моторы для перемещения ДНК через пору. Они обнаружили, что их экспериментальная установка достаточно чувствительна, чтобы наблюдать движения, намного меньшие, чем расстояние между соседними "буквами" на ДНК. Как сообщается в статье, SPRNT более чем в семь раз чувствительнее существующих методов измерения взаимодействий ДНК с белками.
"Как правило, большинство существующих методов для наблюдения за одно-молекулярными движениями — например, оптические пинцеты — имеют разрешение, в лучшем случае, около 300 пикометров", — говорит Гундлах. — "С помощью SPRNT мы можем достичь разрешения в 40 пикометров".
Для справки: 40 пикометров — это 0.000000004 см (около 0.0000000016 дюймов).
"Мы поняли, что можем обнаруживать мельчайшие различия в положении ДНК в поре", — говорит соавтор, постдокторант по физике UW Эндрю Ласло. — "Мы могли улавливать различия в том, как белки связываются с ДНК и перемещают ее через пору".
Эти различия объясняют уникальную роль каждого клеточного белка при взаимодействии с ДНК. В клетках есть белки для копирования ДНК, "считывания" ДНК для экспрессии генов и репарации поврежденной ДНК. Одни белки раскручивают ДНК, другие плотно ее упаковывают.
Биологи давно признали, что белки имеют разную структуру для выполнения этих ролей, но физическое движение белков во время работы с ДНК было трудно обнаружить напрямую.
"Когда у вас есть такое разрешение, которое предлагает SPRNT, вы можете начать различать мельчайшие шаги, которые делают эти белки", — говорит Ласло.
Команда Гундлаха показала, что SPRNT достаточно чувствителен, чтобы различать механизмы, которые два клеточных белка используют для проведения ДНК через нанопоровое отверстие. Один белок, который обычно копирует ДНК, движется вдоль нее по одной "букве" за раз, направляя ДНК через пору. Второй белок, который обычно раскручивает ДНК, делает два шага вдоль каждой "буквы" ДНК, что удалось зафиксировать, отслеживая мельчайшие изменения тока (соавтор, докторант по физике UW Джонатан Крейг). Они даже обнаружили, что эти два шага включают последовательные химические процессы, которые белок использует для "хождения" вдоль ДНК.
"Вы действительно можете увидеть лежащие в основе механизмы, и это имеет массу последствий — от понимания того, как работает жизнь, до дизайна лекарств", — говорит Ласло.
Гундлах считает, что этот инструмент может открыть новое окно для понимания того, как клеточные белки обрабатывают ДНК. Это может помочь в генной инженерии белков для выполнения новых задач. Эти тонкие детали также могут помочь ученым понять, как мутации в белках приводят к заболеваниям, или найти свойства белков, которые были бы идеальными мишенями для лекарственной терапии.
"Например, вирусные гены кодируют свои собственные белки, которые обрабатывают их ДНК", — говорит Гундлах. — "Если мы сможем использовать SPRNT для скрининга лекарств, которые специфически нарушают функционирование этих белков, возможно, это позволит вмешиваться в работу вирусов".