Преодолены ограничения микроскопии сверхвысокого разрешения

Теоретически с помощью микроскопии высокого разрешения можно получать изображения клеточных структур с разрешением в несколько нанометров. Однако на практике этого до сих пор не удавалось достичь.

Причина в том, что для маркировки клеточных структур обычно используются антитела, несущие флуоресцентный краситель. Следовательно, краситель находится не непосредственно на целевой структуре, а примерно в 17.5 нанометрах от неё. Отчасти из-за этой ошибки расстояния теоретически достижимое разрешение до сих пор не было реализовано.

Международная исследовательская группа преодолела это препятствие. Это было достигнуто путём комбинации методов микроскопии сверхвысокого разрешения dSTORM и микроскопии расширения (ExM). Результаты представлены в журнале Nature Communications.

Публикацию возглавила команда из Биоцентра Университета Юлиуса-Максимилиана (JMU) в Вюрцбурге (Германия): профессор Маркус Зауэр, заведующий кафедрой биотехнологии и биофизики, с аспирантами Фабианом Цветтлером и Себастьяном Рейнхардом. Ключевую роль также сыграли профессор Поль Гишар из Женевского университета (Швейцария) и профессор Тоби Белл из Университета Монаша (Австралия).

Препятствия для комбинации dSTORM и ExM

Метод dSTORM, разработанный в группе профессора Зауэра, обеспечивает почти молекулярное разрешение около 20 нанометров. Для дальнейшего увеличения разрешения перспективной казалась комбинация с микроскопией расширения, доступной уже несколько лет.

В ExM исследуемый образец сшивается в набухающий полимер. Затем разрушаются взаимодействия молекул в образце, и образцу дают набухнуть в воде. Это приводит к расширению: молекулы, которые нужно визуализировать, пространственно расходятся в 4 раза.

До сих пор эти два метода не удавалось совместить, потому что флуоресцентные красители, используемые в dSTORM для маркировки молекул, не выдерживали полимеризацию водного геля. Кроме того, для dSTORM необходим буферный раствор, но в таких буферах расширенный образец сжимается до исходного размера.

Ошибка расстояния значительно уменьшена

«Стабилизировав гель и проведя иммунное окрашивание только после расширения, мы смогли преодолеть эти препятствия и успешно объединить два метода микроскопии», — говорит Маркус Зауэр. В результате ошибка расстояния сокращается до всего 5 нанометров при расширении в 3.2 раза. Это впервые делает возможной флуоресцентную визуализацию с молекулярным разрешением.

Чтобы показать эффективность своего метода, исследователи использовали центриоли и структуры, состоящие из белка тубулина. Им удалось визуализировать тубулиновые трубки как полые цилиндры диаметром 25 нанометров. Исследователям удалось чётко сфотографировать группы из трёх тубулиновых структур на расстоянии 15–20 нанометров друг от друга на центриолях. Центриоли — это клеточные структуры, играющие важную роль в делении клеток.

Вывод профессора Зауэра: «Для многих важных клеточных компонентов комбинация ExM и dSTORM теперь впервые позволяет получить детальное представление о молекулярной функции и архитектуре». Команда планирует применять метод к различным структурам, органеллам и мультибелковым комплексам клетки.