Новый высокоскоростной микроскоп визуализирует целые живые организмы с высоким разрешением

Ученые из исследовательского кампуса Janelia Медицинского института Говарда Хьюза разработали микроскоп, который дает более четкое и полное представление о биологических процессах в живых организмах. Он создает изображения целых организмов, таких как эмбрион рыбки данио или плодовой мушки, с разрешением во всех трех измерениях, достаточным для визуализации каждой клетки как отдельной структуры. При этом скорость съемки позволяет наблюдать движение клеток в развивающемся эмбрионе и активность мозга в нейронных цепях.

Руководитель группы в Janelia Филипп Келлер заявил, что его команда создала первый световой микроскоп, способный визуализировать крупные непрозрачные образцы с субсекундным временным разрешением и субклеточным пространственным разрешением во всех измерениях.

Новый микроскоп, названный IsoView light sheet microscope, преодолевает ключевую проблему — улучшает пространственное разрешение — без ущерба для скорости и охвата образца, характерных для предыдущих разработок команды. Описание микроскопа и полные планы его сборки, а также сопутствующего программного обеспечения для обработки изображений, опубликованы 26 октября 2015 года в журнале Nature Methods.

В 2012 году команда Келлера разработала микроскоп SiMView для быстрой трехмерной визуализации крупных образцов. Однако структуры внутри клеток казались размытыми, а клетки в глубине образца плохо различимы.

Принцип работы IsoView

Вместо сбора одного изображения с помощью одного объектива новый микроскоп одновременно собирает свет и создает изображения с нескольких углов. Четыре объектива расположены вокруг образца под прямыми углами друг к другу. Каждый объектив посылает в образец тонкий луч света для его освещения и собирает флуоресцентный свет, излучаемый образцом.

Лучи от четырех объективов расположены со смещением, чтобы не мешать друг другу. Это позволяет микроскопу одновременно собирать четыре разных изображения образца с разных углов без взаимных помех.

Ключевой проблемой стала разработка самих объективов. Ни один коммерчески доступный объектив не соответствовал требованиям команды: они должны были быть достаточно большими для съемки с хорошим разрешением, но при этом компактно размещаться. Команда разработала индивидуальный дизайн деталей, на изготовление которых ушло около 9 месяцев.

Обработка данных

Каждая из четырех камер микроскопа собирает данные для изображения, которое само по себе все еще имеет низкое разрешение в одном измерении. Ученый-компьютерщик Фернандо Амат разработал программное обеспечение для обработки изображений, которое преобразует эти данные в итоговое изображение высокого разрешения. Новый алгоритм ускоряет обработку более чем в 60 раз.

За один час эксперимента четыре камеры sCMOS могут передавать данные со скоростью до 3,2 гигабайта в секунду, что дает около 10 терабайт данных. С новыми алгоритмами набор данных IsoView можно обработать примерно за два дня на одной рабочей станции.

Результаты применения

Ученые использовали IsoView для:

• Визуализации активности нейронов во всей нервной системе живой личинки плодовой мушки — организма с более чем 10 000 нейронов, примерно в 50 раз крупнее круглого червя C. elegans.
• Высокого разрешения функциональной активности во всем мозге личинки рыбки данио, где нейроны в самых глубоких и труднодоступных областях мозга были четко видны отдельно от соседей.
• Отслеживания клеток в развивающемся эмбрионе плодовой мушки с использованием многоканального режима визуализации.

Филипп Келлер отмечает, что возможность визуализации свободно движущейся личинки в геле «открывает перспективу функциональной визуализации всего организма в процессе поведения». Команда планирует продолжить совершенствование технологии IsoView и активно использовать его в биологических экспериментах.