Обнаружен новый путь регуляции через микроРНК для увеличения выхода тромбоцитов из iPS-клеток

Исследователи под руководством профессора Кодзи Это обнаружили важность механизма регуляции на основе микроРНК для повышения качества и количества тромбоцитов, генерируемых мегакариоцитами, полученными из iPS-клеток. Результаты опубликованы в журнале Nature Communications.

Команда признала гетерогенность критической проблемой, препятствующей высококачественному производству тромбоцитов из iPS-клеток (iPSC-PLT) ex vivo из иммортализованных клеточных линий предшественников мегакариоцитов (imMKCLs). Они задались вопросом, можно ли идентифицировать специфические субпопуляции imMKCLs на основе различной активности микроРНК (miRNA).

Используя технологию miRNA switch, исследователи проскринировали библиотеку из более чем 250 miRNA switches и идентифицировали 24 активные miRNA в imMKCLs. Из них они сосредоточились на let-7a-5p и let-7g-5p, так как наблюдали различные субпопуляции imMKCLs с высокой или низкой активностью этих miRNA.

Разделив imMKCLs на субпопуляции с высоким и низким уровнем let-7, они исследовали их паттерны экспрессии генов с помощью bulk RNA-seq. Иммун-ассоциированные гены были обогащены как в пролиферирующих, так и в зрелых imMKCLs с низким уровнем let-7, что характерно для клеток-предшественников мегакариоцитов с иммуномодулирующими функциями.

Аналогичные результаты были получены при анализе транскриптома CD34+ гемопоэтических клеток-предшественников (HPCs) с низким и высоким уровнем let-7, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека. Это показывает, что свойства (тромбопоэтические vs. иммуномодулирующие клетки-предшественники МК) определяются уже на стадии HPC.

Анализ гетерогенности imMKCLs на уровне единичных клеток (scRNA-seq) выявил пять транскриптомически различных субпопуляций, две из которых в основном состояли из imMKCLs с низким уровнем let-7. Эти кластеры, вероятно, представляют собой подмножество с функциональной двойственностью (тромбопоэтической и иммуномодулирующей) и иммуномодулирующее подмножество клеток-предшественников МК.

Обработка imMKCLs ингибитором miRNA let-7a-5p привела к значительной активации иммун-ассоциированных генов (PF4, PPBP, ISG15, IFIT3) в кластерах клеток с низким уровнем let-7. Кроме того, ингибирование let-7 усилило высвобождение провоспалительного цитокина IL-8 в ответ на иммунную стимуляцию, демонстрируя ключевую роль let-7 в определении судьбы иммуномодулирующих imMKCLs.

Биоинформатический анализ для поиска регуляторов, ответственных за транскриптомные изменения в кластерах с низким уровнем let-7, показал:

• Регуляторы, ассоциированные с миелоидным развитием (GATA1, KLF2), были предсказаны как активные в тромбопоэтических imMKCLs.
• IRF7 и IRF3 (активаторы вирус-индуцируемых генов) были предсказаны как активные в иммуномодулирующих imMKCLs.

Из 20 регуляторов, предсказанных как активные в обоих кластерах, CUX1 и RALB были активированы при ингибировании let-7. При этом:

• Сверхэкспрессия CUX1 не повлияла на экспрессию IRF7, ISG15 и IFIT3.
• Сверхэкспрессия RALB значительно усилила экспрессию этих генов интерферонового сигналинга, но не повлияла на тромбопоэз-ассоциированные гены. Это говорит о том, что RALB действует ниже let-7 miRNA, специфично регулируя иммун-ассоциированные гены.

На основе этих знаний команда продемонстрировала, что как генетическое, так и фармакологическое ингибирование RALB может улучшить пролиферацию imMKCLs и продукцию тромбоцитов.

В ходе исследования был раскрыт ранее неизвестный регуляторный путь let-7–RALB, что будет способствовать улучшению промышленного производства iPSC-PLTs для клинического применения.