Увидеть клетки цветка в 3D без электронного микроскопа

Ученым необходимы изображения растительных клеток высокого разрешения для изучения всего — от грибковых инфекций до репродукции у кукурузы. Такие изображения получают с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM), где электронный микроскоп фокусирует пучки электронов для увеличения объектов. SEM — распространенный метод во всех областях науки.

Однако подготовка объектов для SEM и других распространенных методов визуализации может повредить хрупкие биологические образцы. Лиофильная сушка материала, электронные пучки и вакуумное давление в микроскопе могут привести к повреждению клеток, что проблематично для визуализации их формы, размера и развития. Кроме того, подготовка материала для просмотра под микроскопом с помощью SEM требует специализированного оборудования, что приводит к низкой пропускной способности и создает большую финансовую нагрузку на научные лаборатории.

Исследователи из Университета Флориды разработали новые методы менее разрушительного, более экономичного и высокопроизводительного подхода к визуализации клеточной структуры. «Для визуализации клеток различного растительного материала, — объясняет исследователь Джейкоб Лэндис, — существуют альтернативы широко используемой SEM. Некоторые из этих альтернатив могут быть более доступны для исследователей и не требуют специализированного оборудования для обработки перед визуализацией».

Лэндис и коллеги создали протоколы для метода оптической секционной 3D-реконструкции, использующего флуоресцентный световой микроскоп. Составной микроскоп имеет несколько линз для отражения света и проецирования изображения с высоким увеличением. Микроскоп и установленная камера «секционируют» растительные клетки, захватывая изображения нескольких слоев и плоскостей образца. Изображения реконструируются в итоговое 3D-изображение с разрешением, равным или более высоким, чем у изображений, полученных с помощью SEM.

Лэндис разработал новый протокол (подробно описанный в недавнем выпуске Applications in Plant Sciences), чтобы увидеть эпидермальные клетки на поверхности лепестков цветов. Эта группа клеток раскрывает обширную информацию для генетиков, агрономов и экологов. Эпидермальные клетки цветка вызывают все типы изменений на клеточном уровне, которые могут влиять на цвет и развитие цветка, а также на экологические взаимодействия, такие как успех растения в привлечении опылителей и избегании насекомых-врагов.

В отличие от SEM, материал для визуализации новым методом сохраняется, что позволяет получать четкие изображения спустя месяцы после сбора образцов. Это ценно, когда исследования требуют массовой обработки образцов. Затем материал обезвоживают в этаноле, погружают в жидкость для удаления восковой пленки, защищающей внешний слой клеток лепестка, и монтируют в флуоресцентный краситель для улучшения визуализации деталей под микроскопом.

Метод был разработан в рамках более масштабного исследования клеточной и генетической основы размера цветка у лесной группы растений Saltugilia. Растения Saltugilia имеют большой диапазон размеров цветков и принимают различные типы опылителей — включая колибри, пчел и жужжал, — в то время как некоторые вообще не имеют опылителей. SEM нельзя было использовать для изучения этих разнообразных цветов, поскольку он ограничен образцами размером 3–5 мм. Новый подход с оптической секционной 3D-реконструкцией позволяет визуализировать образцы размером до 5 см, не разрезая лепестки и не нарушая клеточную структуру лепестка.

Оптическая секционная и 3D-реконструкция были неформально протестированы на другом растительном материале, включая клетки листьев и репродуктивные органы (тычинки, пыльники и чашелистики). «Мы считаем, что можно будет визуализировать любой тип ткани, который можно смонтировать на предметном стекле микроскопа, — говорит Лэндис. — Я провел много времени, используя SEM и подготавливая образцы, и оптическая секционная с 3D-реконструкцией — безусловно, самый простой и экономически эффективный метод, который я когда-либо использовал».