Открыт новый механизм поддержания стабильности генома
Для бактерии это наихудший сценарий: во время транскрипции новосинтезированная РНК прилипает к своей ДНК-матрице, образуя трёхцепочечную структуру, известную как R-петля. Хотя эти структуры играют в клетке некоторые важные роли, R-петли в неправильном месте и в неправильное время могут быть катастрофическими, приводя к разрывам ДНК, мутациям и гибели клетки.
Новое исследование, опубликованное в Nature Structural & Molecular Biology, описывает, как фермент RapA предотвращает образование R-петель в E. coli, что имеет далеко идущие последствия для понимания того, как все клетки поддерживают стабильность генома. Результаты показывают, что при определённых обстоятельствах фермент РНК-полимераза (RNAP), ответственный за копирование ДНК в РНК, может генерировать массовые R-петли — если бы не вмешательство белка RapA.
"R-петли — это, как правило, плохие новости, поэтому у клеток есть множество избыточных механизмов, чтобы предотвратить их образование. Мы обнаружили, что RapA, белок, который интересовал нас годами, является одним из таких ключевых механизмов", — говорит Сет Дарст, руководитель Лаборатории молекулярной биофизики.
"Челюсти" жизни
Все живые существа полагаются на RNAP для транскрипции ДНК в РНК. У бактерий давно известно, что транскрипция начинается, когда RNAP зажимает нить ДНК и запускает процесс после получения "зелёного света" от сигма-белков. Но детали завершения транскрипции остаются неясными. Новые исследования показали, что RNAP часто остаётся зажатой на ДНК даже после высвобождения новообразованной РНК — почему и как это происходит, было плохо понятно.
В 1990-х годах лаборатория Дарста открыла RapA, АТФазу, которая явно взаимодействовала с RNAP, но без очевидной функции. "В то время мы действительно не могли понять, что делает RapA", — говорит он. Однако спустя несколько десятилетий, когда отдельная исследовательская группа обнаружила, что E. coli, подвергнутая стрессовым условиям с высоким содержанием соли, не может расти без RapA, интерес Дарста к загадочному белку возродился.
Его команда использовала крио-ЭМ, чтобы изучить, как RNAP остаётся зажатой на ДНК после терминации транскрипции и как с ней взаимодействует RapA. Они выбрали отрицательно суперспирализованную ДНК — недоскрученную и скрученную форму двойной спирали, — потому что она лучше имитирует естественное состояние бактериальной ДНК, чем линейная ДНК, часто используемая в структурных исследованиях.
"Наше исследование — одно из первых, в котором используется отрицательно суперспирализованная ДНК в эксперименте с крио-ЭМ, — говорит первый автор Джошуа Брюэр, разработавший эксперимент. — Этот метод помог нам лучше визуализировать топологическое состояние ДНК, как белки перестраиваются и как они взаимодействуют с ДНК".
Они с удивлением обнаружили, что RNAP редко остаётся бездействующей, когда она зажата на ДНК после завершения транскрипции. Вместо этого она может снова инициировать транскрипцию, на этот раз без обычной защиты сигма-белков. В отсутствие сигма-фактора инициация транскрипции образует вредные R-петли, если RapA не может вмешаться первым, разжимая "зажим" RNAP.
"RNAP похожа на большой коготь, который смыкается вокруг ДНК, — говорит Дарст. — RapA связывается с RNAP и разжимает этот зажим, так что он отпадает от ДНК, прежде чем сможет создать R-петли".
За пределами бактерий
Стала вырисовываться более ясная картина роли RapA. Когда команда подвергла бактерий, лишённых RapA, стрессовым условиям с высоким содержанием соли, у микробов наблюдалась генетическая нестабильность — свидетельство того, что RNAP с большей вероятностью остаётся зажатой на ДНК и с большей вероятностью образует R-петли при определённых обстоятельствах.
Они также выяснили, что хотя у E. coli также есть хорошо изученный фермент Rho, способный разрывать R-петли, он не может полностью компенсировать отсутствие RapA. "Когда вы выключаете RapA, Rho приходится работать сверхурочно, — говорит Брюэр. — Похоже, что RapA и Rho работают как дополнительные, а не избыточные защитные механизмы для стабильности генома, когда E. coli подвергается стрессу от высокой концентрации соли".
Последствия могут быть обширными. Дарст, Брюэр и коллеги предполагают, что RapA — или что-то подобное (так называемый фактор высвобождения RNAP) — существует не только в E. coli, но и у всех бактерий и, возможно, во всех клетках. Обнаружение подобных механизмов у других организмов может вдохновить на новые стратегии для борьбы с заболеваниями, связанными с нестабильностью генома из-за нарушений транскрипции.
"Мы предполагаем, что другие ферменты, вероятно, выполняют аналогичные функции по всему древу жизни, — говорит Дарст. — Чем больше мы узнаём об этих механизмах, тем глубже становится наше понимание того, как клетки защищают свои геномы".