Метод редактирования генов создаёт идеальные плюрипотентные стволовые клетки-близнецы

Исследователи под руководством доктора Кнута Вольтена сообщают о новом методе редактирования генов, который может модифицировать единственный нуклеотид в геноме человека с абсолютной точностью. Техника, описанная в Nature Communications, уникальна тем, что направляет собственные механизмы репарации клетки по замыслу учёных, создавая пары генетически совпадающих клеток для изучения мутаций, связанных с болезнями.

Единичные мутации в ДНК, известные как однонуклеотидные полиморфизмы (SNP), — самый распространённый тип вариаций в геноме человека. Известно более 10 миллионов SNP, многие из которых ассоциированы с такими недугами, как болезнь Альцгеймера, сердечные заболевания и диабет. Чтобы понять роль SNP в наследственных болезнях, учёные из Центра исследования и применения iPS-клеток (CiRA) Университета Киото создают индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPS-клетки) от пациентов-доноров.

iPS-клетки сохраняют генетический состав донора и могут быть преобразованы в любой тип клеток организма. Таким образом, в лаборатории можно создавать и наблюдать клетки тканей, например, мозга, сердца или поджелудочной железы, что позволяет безопасно тестировать новые методы лечения до начала клинических испытаний.

Для доказательства причинно-следственной связи SNP с заболеванием требуются строгие сравнения с генетически совпадающими, или изогенными, iPS-клетками. Идеальными являются клетки-"близнецы", геномы которых различаются только одним SNP. Однако, как отмечает соавтор исследования доктор Шин-Иль Ким, создание таких близнецов — нетривиальная задача.

"Обычно нам нужно добавлять ген устойчивости к антибиотику вместе с SNP, чтобы преодолеть низкую эффективность. Поскольку это вносит ещё одно изменение в геном, нам также нужен способ его удалить".

Для создания изогенных близнецов лаборатория Вольтена разработала новую технологию редактирования генома, которая вставляет модификацию SNP вместе с репортёрным геном флуоресценции, служащим сигналом для детекции модифицированных клеток. Они также сконструировали короткую дуплицированную последовательность ДНК, известную как микрогомология, по обе стороны от репортёрного гена, а также уникальные сайты-мишени для фермента CRISPR, разрезающего ДНК.

Эти особенности позволили исследователям использовать эндогенную систему репарации ДНК в клетке, называемую соединением концов, опосредованным микрогомологией (MMEJ), для точного удаления репортёрного гена. MMEJ удаляет флуоресцентный репортёрный ген, оставляя только модифицированный SNP. Располагая мутантный SNP в одной микрогомологии, а нормальный — в другой, метод эффективно генерирует изогенных близнецов.

Доктор Кнут Вольтен, адъюнкт-профессор CiRA, назвал новый метод редактирования генов MhAX (Microhomology-Assisted eXcision). Вдохновением послужило наблюдение за естественным процессом репарации MMEJ в ответ на повреждение ДНК.

"Чтобы MhAX работал, мы дублируем последовательности ДНК, уже присутствующие в геноме. Затем мы позволяем клеткам разрешить это дублирование. В то же время клетки решают, какие SNP останутся после репарации", — объясняет он. "Один эксперимент даёт полный спектр возможных генотипов SNP".

В сотрудничестве с доктором Такаши Ямамото из Университета Хиросимы и доктором Томоёши Сога из Университета Кейо лаборатория Вольтена использовала MhAX для создания SNP в генах HPRT и APRT, мутации которых ассоциированы с подагрой и болезнью почек соответственно.

Биохимические анализы показали, что клетки с мутантным SNP в HPRT имели изменённый метаболизм, аналогичный наблюдаемому у пациентов, в то время как клетки-близнецы изогенного контроля, полученные в том же эксперименте, были нормальными. Мутация APRT*J, часто встречающаяся у японских пациентов с острой почечной недостаточностью, продемонстрировала высокую эффективность MhAX, поскольку для изучения эффектов мутации требовалось редактирование обеих копий гена (от матери и от отца).

Лаборатория Вольтена уже начала применять свой метод для создания и коррекции SNP в генах, связанных с другими заболеваниями. Сотрудничая с исследователями из Японии и Канады, они изучают генетическую причину тяжёлого диабета у юных пациентов.

Клинические испытания методов лечения диабета с использованием эмбриональных стволовых клеток уже ведутся, но они требуют хронической иммуносупрессии. Генная коррекция собственных iPS-клеток пациента может привести к созданию источника здоровых инсулин-продуцирующих клеток поджелудочной железы со сниженным риском отторжения после трансплантации.

"Наша цель — создавать технологии редактирования генов, которые улучшают наше понимание механизмов болезней и в конечном итоге приводят к терапиям", — сказал Вольтен. "Мы уверены, что MhAX найдёт широкое применение в современных исследованиях болезней человека и за их пределами".