Млекопитающие клетки производят более долгоживущий терапевтический белок эритропоэтин
Эритропоэтин (EPO) — ключевой регулятор производства красных кровяных телец — широко используется для лечения некоторых видов рака и анемии, вызванной хронической болезнью почек. Однако время нахождения EPO в кровотоке зависит от степени его модификации сахарными цепями, содержащими сиаловую кислоту. Эта модификация, называемая сиалилированием, предотвращает захват и разрушение гликозилированного EPO клетками печени. Полностью модифицированный сахарами с сиаловой кислотой EPO сохраняется в кровотоке около часа — в пять раз дольше, чем несиалилированный EPO.
Поскольку до 80% производимого EPO выбрасывается из-за недостаточного сиалилирования, оптимизация этого процесса может снизить стоимость и дозировку терапии EPO.
Ранее команда под руководством Чживэя Сонга из A*STAR Bioprocessing Technology Institute в Сингапуре повысила уровень сиалилирования EPO в клетках млекопитающих с дефицитом фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы (GnT I), введя в клеточную линию функциональный ген GnT I. Сиалилирование EPO в генетически модифицированных клетках было почти на 25% выше, чем в клетках дикого типа, при культивировании в лабораторных условиях.
Теперь та же группа улучшила возможности этой линии, используя процесс метотрексатной амплификации, чтобы увеличить выход сиалилированного EPO дополнительно в 2,5 раза. Более того, повышенный выход может быть достигнут в условиях, релевантных для промышленности.
Процесс включает:
- Инактивацию гена, который обычно производит дигидрофолатредуктазу (DHFR) в клеточной линии с дефицитом GnT I.
- Экспрессию сегмента чужеродной ДНК, кодирующей EPO, DHFR и чужеродный фермент GnT I.
Поскольку метотрексат ингибирует DHFR, что важно для выживания клеток, обработка этой модифицированной клеточной линии возрастающими концентрациями метотрексата отбирает клетки, имеющие множественные копии гена DHFR на чужеродном сегменте ДНК. Поскольку эти клетки также имеют множественные копии соседних генов EPO и GnT I, процесс также повышает уровень полностью сиалилированного EPO.
Исследователи протестировали содержание сиаловой кислоты в EPO, произведённом из лучшей линии, и обнаружили, что оно более чем на 60% выше, чем количество, производимое существующей промышленной линией.
Хотя полученные выходы всё ещё недостаточно высоки для производства промышленно значимых уровней EPO, Сонг уверен, что дополнительные раунды метотрексатной амплификации и модификация среды и других условий культивирования могут ещё больше увеличить выход. Он добавляет: «Оптимальное гликозилирование — важный фактор для регуляторного использования многих белковых препаратов. Так что наша стратегия может найти применение не только для EPO».