Видеонаблюдение за репликацией одиночной молекулы ДНК

Учёные впервые смогли наблюдать репликацию одиночной молекулы ДНК. Исследование выявило неожиданно высокую степень случайности в этом процессе.

"Это иной способ мышления о репликации, который поднимает новые вопросы", — заявил Стивен Ковальчиковски, профессор микробиологии и молекулярной генетики Калифорнийского университета в Дэвисе. Работа опубликована 15 июня в журнале Cell.

Используя сложную визуализацию, исследователи наблюдали за репликацией ДНК бактерии E. coli и измеряли скорость работы ферментных комплексов на разных цепях.

Основы репликации ДНК

Двойная спираль ДНК состоит из двух цепей, идущих в противоположных направлениях. Фермент хеликаза расплетает спираль на две одинарные цепи. Затем ДНК-полимераза присоединяется и движется по цепи, добавляя новые "буквы" (нуклеотиды).

На ведущей цепи полимераза движется непрерывно. На отстающей цепи синтез происходит фрагментарно: полимераза присоединяется, синтезирует короткий фрагмент, отсоединяется и начинает снова. Считалось, что полимеразы на обеих цепях скоординированы.

Эксперимент: "катящиеся кольца" и флуоресцентный краситель

Исследователи использовали кольцевую молекулу ДНК, прикреплённую к стеклу коротким "хвостом". По мере движения репликационной машины хвост удлинялся. Добавление флуоресцентного красителя, связывающегося с двуцепочечной ДНК, подсвечивало растущие цепи. Всё это помещалось в проточную камеру, где цепи вытягивались.

Остановки, старты и переменные скорости

Наблюдение за отдельными молекулами ДНК показало неожиданное: репликация останавливается непредсказуемо, а при возобновлении её скорость может меняться.

"Скорость может различаться примерно в десять раз", — отметил Ковальчиковски.

Иногда синтез на отстающей цепи останавливается, а на ведущей продолжается. Это проявляется как тёмная область в светящейся нити, поскольку краситель не связывается с одноцепочечной ДНК.

"Мы показали, что между цепями нет координации. Они полностью автономны", — заявил Ковальчиковски.

То, что выглядело как координация, на самом деле является результатом случайного процесса стартов, остановок и переменных скоростей. Со временем любая цепь движется со средней скоростью; если смотреть на множество цепей одновременно, они будут иметь одинаковую среднюю скорость.

"Ручка мёртвого человека" для хеликазы

Исследователи также обнаружили своеобразный "автоматический тормоз" у хеликазы. Когда полимераза останавливается, хеликаза может продолжить движение, потенциально создавая уязвимый участок расплетённой ДНК. Однако оказалось, что когда хеликаза "отрывается" от репликационного комплекса, она замедляется примерно в пять раз. Таким образом, она может медленно двигаться, пока остальные ферменты не догонят её, а затем снова ускориться.

Этот новый стохастический подход меняет представление о репликации ДНК и других биохимических процессах. "Это настоящая смена парадигмы, которая подрывает многое из того, что написано в учебниках", — заключил Ковальчиковски.