ДНК-репликация под микроскопом

Криоэлектронная микроскопия (крио-ЭМ) позволила исследователям изучить, как собирается аппарат репликации ДНК в местах повреждения ДНК.

Клеточная ДНК постоянно подвергается воздействию как эндогенных, так и экзогенных повреждающих агентов, таких как активные формы кислорода и УФ-излучение. Чтобы уменьшить биологические последствия повреждения ДНК, все живые организмы выработали механизмы для толерантности и репарации повреждений, чтобы попытаться обеспечить точное наследование генетической информации. Один из таких механизмов, называемый транслезионным синтезом (TLS), позволяет репликации ДНК продолжаться через нерепарированные повреждения.

TLS включает временную замену высокоточных ДНК-синтезирующих ферментов (репликативных ДНК-полимераз) специализированными, низкоточными TLS-полимеразами, которые могут обеспечить выживание клетки ценой внесения мутаций. Мутагенная и транслезионная активность TLS-полимераз может привести к превращению нормальных клеток в раковые или к развитию лекарственной устойчивости раковых клеток.

Y-семейство TLS-полимераз Pol_K способно осуществлять синтез ДНК через несколько поврежденных оснований и рекрутируется к повреждениям с помощью пролиферирующего клеточного ядерного антигена (PCNA). Предыдущие исследования показали, что PCNA регулируется убиквитинированием. «Добавление одной молекулы убиквитина к остатку лизина 164 (K164) PCNA облегчает рекрутирование и удержание TLS-полимераз в местах повреждений, но структурная основа взаимодействия между этими полимеразами и убиквитинированным PCNA плохо изучена», — говорит структурный биолог Альфредо Де Бьязио из KAUST.

Группа Де Бьязио сотрудничает с лабораторией Самира Хамдана, эксперта по одномолекулярному анализу репликации ДНК человека, с 2018 года. Они используют крио-ЭМ для исследования трехмерной структуры и функции ключевых белковых комплексов, участвующих в репликации и репарации ДНК.

Их последнее исследование описывает крио-ЭМ реконструкции полноразмерного человеческого Pol_K, связанного с ДНК, входящим нуклеотидом и немодифицированным PCNA или моно-убиквитинированным PCNA, с разрешением, близким к атомарному. Они обнаружили, что в отсутствие ДНК структура Pol_K, связанного с PCNA, является высоко гибкой, что предполагает необходимость связывания с ДНК для формирования жесткого и активного комплекса.

Мухаммад Техсин, старший исследователь в группе Хамдана и соавтор исследования, провел ключевые функциональные исследования, объясняющие, как убиквитинирование PCNA модулирует активность Pol_K.

«Наши данные предоставляют структурную основу для объяснения того, как PCNA рекрутирует TLS-полимеразу Y-семейства к местам повреждения ДНК», — объясняет Техсин. Из-за высокой степени консервативности доменов среди Y-семейства полимераз, некоторые структурные особенности, наблюдаемые в комплексе Pol_K-ДНК-PCNA, вероятно, применимы и к другим TLS-полимеразным комплексам.

«Понимая взаимодействия между белками, формирующими эти комплексы, и то, как они регулируются, мы можем определить способы уменьшения или увеличения их функции для медицинских применений», — заключает он.