Новый метод отслеживает связывание ДНК с белками в реальном времени в живых клетках
Исследователи разработали технологию SpDamID, которая точно маркирует места связывания регуляторных белков — транскрипционных факторов — с ДНК в ядрах живых клеток.
Метод, описанный 6 августа в журнале Molecular Cell, позволяет ответить на фундаментальные вопросы о развитии тканей и болезнях, недоступные для существующих технологий.
Проблема существующих методов
Ключевые клеточные процессы регулируются множеством транскрипционных факторов. Мутации в них или в ДНК могут приводить к болезням. Для понимания этих процессов необходимо отслеживать, где и как факторы связываются с ДНК.
Стандартный метод ChIP-seq имеет ограничения:
- Не даёт картины связывания в единичной клетке.
- Анализирует популяцию клеток после воздействия токсичных химикатов.
- Выводы о совместном связывании разных факторов строятся на предположениях.
Принцип работы SpDamID
Технология основана на методе DamID, использующем фермент DNA adenine methyltransferase (Dam).
Новый подход:
- Фермент Dam расщепляется на две неактивные половины.
- Эти половины присоединяются к двум интересующим исследователя белкам.
- Если эти белки связываются близко друг к другу на одной цепи ДНК, фермент восстанавливает активность и маркирует это место в хромосоме.
Ключевые преимущества:
- Реакция происходит только при одновременном связывании двух белков в одной клетке, что устраняет неоднозначность.
- Требует меньше клеток, чем ChIP-seq.
- Позволяет изучать процессы в малых популяциях клеток или кратковременные события.
Демонстрация на примере белка Notch
В исследовании метод протестировали на клетках-предшественниках почки мыши (mK4), анализируя Notch-опосредованную транскрипционную активацию. Notch — критический белок для развития тканей, связанный с такими заболеваниями, как синдром Алажилля, рак, CADASIL и рассеянный склероз.
Результаты:
- SpDamID позволил идентифицировать все ключевые сайты связывания Notch (который сам по себе не связывается с ДНК напрямую).
- Было показано, что сайты связывания Notch находятся рядом с сайтами для другого транскрипционного фактора — Runx1.
- Метод впервые доказал, что Notch и Runx1 связываются с одной и той же хромосомой в одной и той же клетке — что невозможно было установить с помощью ChIP-seq.
Перспективы
SpDamID предоставляет инструмент для сравнения связывания любых транскрипционных факторов в нормальных и болезненных клетках, что может привести к новому пониманию механизмов заболеваний. Полное влияние технологии на научное сообщество станет ясно в ближайшие годы.