Архитектура ДНК в живой клетке в реальном времени

В ядре человеческой клетки примерно два метра ДНК свернуты в многослойную 3D-структуру — хроматин. Это позволяет всей нашей генетической информации упаковаться в крошечное пространство.

Эта 3D-сеть ДНК — наш геном. Интересно, что полное секвенирование генома показало: только 2% его составляют гены, кодирующие белки, необходимые для жизни, роста и размножения.

Остальные 98% — некодирующая ДНК — раньше считались «мусорной ДНК». Но это не так.

Хотя функция большей части некодирующего генома все еще неизвестна, появляется все больше доказательств, что он каким-то образом участвует в организации динамических структурных перестроек ДНК, которые включают и выключают разные белок-кодирующие гены.

Наблюдение за ДНК в действии

ДНК состоит из последовательности молекул, обозначаемых буквами A, C, G и T. Но чтобы понять остальные 98% нашего генома, нужно выйти за рамки линейного шаблона ДНК и изучить, как геном работает в 3D-ядре клетки.

Непосредственно наблюдать динамику всего генома в живой клетке и локальные перестройки ДНК, регулирующие экспрессию генов, — огромная проблема. ДНК очень мала, а изменения настолько тонкие, что их не видно в оптический микроскоп.

Существует предел разрешаемой пространственной детализации, вызванный явлением дифракции. Свет, сфокусированный линзой микроскопа, образует размытое фокальное «пятно» шириной примерно 250 нанометров (для зеленого света).

Это слишком много, чтобы увидеть, как шаблон ДНК сворачивается и разворачивается в ядре живой клетки. Наномасштабные особенности структуры генома, такие как расстояние между субъединицами нуклеосомами (геномные «бусины» ДНК, намотанные на белковое ядро из гистонов), остаются невидимыми.

Преодоление дифракции

Нуклеосомы впервые были идентифицированы с помощью электронной микроскопии, которая использует пучок электронов вместо света. Но этот метод требует фиксации клеток, поэтому можно получить только статические снимки.

Сейчас мы находимся в захватывающей фазе развития оптической микроскопии, когда дифракционный предел можно либо «преодолеть», либо полностью избежать, используя сверхразрешенные считывания архитектуры генома.

Ключ — флуоресценция. Это явление, при котором молекула-флуорофор поглощает свет, а затем испускает его на более длинной волне. Мы можем пометить нашу ДНК флуорофорами разного цвета и, наблюдая за их флуоресценцией с помощью специальных микроскопов, увидеть детали, далеко выходящие за пределы дифракции.

Эти новые флуоресцентные методы могут предоставить сверхразрешенную информацию об архитектуре генома с точностью до нескольких нанометров. Возможность отслеживать эту архитектуру в реальном времени означает, что теперь можно увидеть динамику сети ДНК, которую, как предполагается, регулирует некодирующая ДНК.

Молекулярная линейка

В нашей лаборатории мы исследуем роль 3D-организации и динамики генома, добавляя зеленые и красные флуоресцентные белки к гистонам, которые упаковывают ДНК в нить «бусин».

Затем мы ищем явление резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET). При FRET донорная флуоресцентная молекула передает поглощенную энергию близкой акцепторной молекуле. Поскольку это явление чрезвычайно чувствительно к расстоянию между молекулами в масштабе от 1 до 10 нанометров, обнаружение FRET может служить своего рода молекулярной линейкой.

Таким образом, в изображении с дифракционным ограничением, вычисляя, где флуорофоры отдают и принимают энергию, можно измерить наномасштабное расстояние между мечеными нуклеосомами вдоль шаблона ДНК внутри каждого размытого пятна шириной ~250 нм. Это позволяет наблюдать минимальные изменения в архитектуре ДНК.

Используя флуоресцентный микроскоп, специально предназначенный для пространственного картирования этих событий, мы обнаружили наномасштабные перестройки в ДНК, обеспечивающие точную передачу нашего генома. В частности, впервые мы увидели структурные изменения в ДНК, которые способствуют прибытию ремонтного аппарата к местам повреждения ДНК.

Наша работа на сегодняшний день предполагает, что архитектура хроматина служит «дорожной картой» для ДНК-связывающих белков, осуществляющих надзор за геномом и локальный ремонт ДНК при возникновении повреждений.

В следующий раз, когда вы услышите слова «мусорная ДНК», помните — это не мусор. Если присмотреться гораздо, гораздо ближе, это постоянно меняющийся план для навигации по геному.