Модифицированная форма CRISPR действует как переключатель для контроля экспрессии генов в стволовых клетках
Ученые из Институтов Гладстона впервые модифицировали считывание генома индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) с использованием варианта системы CRISPR-Cas9. Это достижение представляет собой значительный технологический прорыв в создании клеточных моделей генетических заболеваний.
В исследовании, опубликованном в Cell Stem Cell, ученые использовали модифицированную версию CRISPR под названием CRISPR-интерференция (CRISPRi) для инактивации генов в iPSC и в клетках сердца, созданных из iPSC. Метод, впервые описанный в 2013 году соавтором текущей работы Стэнли Ци, значительно улучшает оригинальную систему CRISPR-Cas9, позволяя более точно и эффективно «заглушать» или отключать гены. CRISPRi также обеспечивает гибкость, позволяя обратить подавление гена вспять и точно контролировать его степень.
Стандартная система CRISPR использует белок Cas9 для удаления точного участка генома, делая небольшие разрезы в ДНК клетки. CRISPRi развивает эту технологию, используя специальную деактивированную версию белка Cas9 и дополнительный белок-ингибитор KRAB. Вместе эти белки связываются с целевым участком генома и подавляют экспрессию гена, не разрезая ДНК. К удивлению ученых, временное подавление экспрессии гена таким способом оказалось гораздо более стабильным, чем постоянное разрезание генома.
«Мы были поражены разительной разницей в эффективности между двумя системами, — сказал старший автор Брюс Конклин. — Мы думали, что постоянное разрезание генома будет более эффективным способом заглушить ген, но на самом деле CRISPRi настолько точен и так плотно связывается с геномом, что это действительно лучший способ».
В исследовании ученые сравнили, насколько хорошо CRISPRi и CRISPR-Cas9 подавляли конкретный ген, контролирующий плюрипотентность iPSC — их способность превращаться в различные типы клеток. Они обнаружили, что CRISPRi был намного эффективнее: в более чем 95% клеток, созданных с помощью CRISPRi, целевой ген был заглушен, по сравнению с лишь 60-70% клеток, полученных с помощью CRISPR-Cas9. CRISPRi также не вызывал каких-либо нецелевых изменений в экспрессии генов, таких как нежелательные вставки или делеции в геноме клетки, что является проблемой для CRISPR-Cas9.
CRISPRi также действовал как переключатель, позволяя ученым отменить подавление гена, просто удалив химическое вещество, активирующее ингибитор гена. Кроме того, исследователи смогли регулировать степень подавления гена, изменяя количество добавляемых химических веществ. Оба этих результата открывают путь к более универсальному исследованию роли определенных генов в развитии и заболеваниях.
Ученые продемонстрировали расширенные возможности CRISPRi в iPSC, Т-клетках и клетках сердца, созданных из стволовых клеток. Например, они создали модель сердечного заболевания, отредактировав геном для подавления гена, необходимого для работы сердца.
«CRISPRi имеет большое преимущество в создании типов клеток, релевантных для заболеваний, — сказал первый автор Мохаммад Мандегар. — Используя эту технологию, мы можем смоделировать заболевание в однородной популяции клеток сердца, созданных из iPSC. Это достижение позволяет нам легче изучать генетические заболевания и потенциально находить новые терапевтические мишени».