CRISPR/Cas9 для тонкой настройки экспрессии miRNA у тетраплоидного картофеля

МикроРНК (miRNA) играют ключевую роль в регуляции генов растений. Тонкая настройка miRNA — мощный биотехнологический подход для улучшения характеристик растений, например, повышения устойчивости к стрессу.

Регуляция РНК с помощью технологии редактирования генов CRISPR/Cas9 — актуальная область исследований. Культурный картофель (Solanum tuberosum L.) — тетраплоид и одна из важнейших мировых сельхозкультур, однако CRISPR/Cas9-опосредованное редактирование miRNA у картофеля ранее не изучалось.

В июне 2022 года журнал Horticulture Research опубликовал статью "CRISPR/Cas9-mediated fine-tuning of miRNA expression in tetraploid potato".

Методы и результаты

Исследование использовало комплексный CRISPR-Cas9 подход для модуляции экспрессии miRNA, интегрируя:

Ключевые выводы:

  1. Анализ мутаций: Высокоразрешающий анализ плавления (HRM) эффективно оценивал функциональность sgRNA, выявляя разнообразные мутации в протопластах. Мутации подтверждены для MIR160a и MIR160b, но не для MIR390a.
  2. Стабильно трансформированные растения: В разных генотипах и трансгенных линиях наблюдались разнообразные мутации, чаще всего — делеции и инсерции. Мутации не всегда находились в предсказанных сайтах разреза.
  3. Эффективность: Эффективность трансформации и частота мутаций варьировались в зависимости от сорта картофеля и штамма Agrobacterium.
  4. Экспрессия miRNA: Уровень miRNA коррелировал с типом и количеством мутаций, что согласовывалось с предсказаниями эффективности процессинга pre-miRNA. Несмотря на мутации, экспрессия некоторых miRNA сохранялась.
  5. Новые варианты miRNA: CRISPR-Cas9 индуцировал появление новых вариантов miRNA. Некоторые сохраняли функциональность, но у большинства изменилось связывание с мишенями, что повлияло на биологическую функцию. Снижение уровня зрелой miRNA из-за мутаций коррелировало с негативной регуляцией их мишеней.
  6. Подтверждение эффективности: Высокая эффективность редактирования подтверждена детекцией трансгенов, экспрессии Cas9 и мутаций во всех трансгенных линиях.

Заключение

Исследование демонстрирует эффективное использование CRISPR/Cas9 для тонкой настройки экспрессии miRNA у полиплоидных видов, таких как картофель, преодолевая ограничения традиционных нокаут-мутантов. Метод валидирован на разных генотипах картофеля и открывает значительный потенциал для прецизионной селекции и модуляции физиологии растений.

2023-12-21