Прорыв в клеточной инженерии: высокоэффективный CRISPR без вирусных векторов

Новый вариант системы редактирования генов CRISPR-Cas9 упрощает перепрограммирование огромного количества клеток для терапевтического применения. Метод, разработанный в Институтах Гладстоуна и Калифорнийском университете в Сан-Франциско (UCSF), позволяет вводить особенно длинные последовательности ДНК в точные места в геномах клеток с высокой эффективностью, без использования традиционных вирусных систем доставки.

"Одной из наших целей на протяжении многих лет была доставка длинных инструкций ДНК в целевой участок генома способом, не зависящим от вирусных векторов", — говорит Алекс Марсон, старший автор исследования. "Это огромный шаг к следующему поколению безопасных и эффективных клеточных терапий".

В новой статье, опубликованной в журнале Nature Biotechnology, Марсон и его коллеги не только описывают технологию, но и показывают, как её можно использовать для генерации CAR-T-клеток с потенциалом борьбы с множественной миеломой, а также для перезаписи генетических последовательностей, мутации в которых могут приводить к редким наследственным иммунным заболеваниям.

"Мы показали, что можем модифицировать более миллиарда клеток за один запуск, что намного превышает количество клеток, необходимое для лечения одного пациента", — говорит первый автор Брайан Шай.

От двухцепочечной к одноцепочечной ДНК

CRISPR-Cas9, система для редактирования генов внутри живых клеток, использовалась как базовый исследовательский инструмент последнее десятилетие. Многие клиницисты всё больше интересуются её потенциалом для создания живых клеточных терапий.

С помощью редактирования генов можно выключить, удалить или заменить мутировавший ген, вызывающий болезнь, или усилить противораковую активность иммунной клетки. Хотя первые терапевтические применения CRISPR-Cas9 недавно вошли в клинические испытания, технология всё ещё ограничена сложностью безопасного получения больших количеств правильно отредактированных клеток.

Традиционно исследователи полагались на вирусные векторы — оболочки вирусов без их болезнетворных компонентов — для доставки ДНК (называемой ДНК-шаблоном) в клетки. Однако производство больших количеств клинических вирусных векторов стало основным узким местом в создании клеточных терапий для пациентов. Кроме того, исследователи не могут легко контролировать, куда традиционные вирусные векторы встраивают гены в геноме.

"Использование вирусных векторов дорого и ресурсоёмко", — говорит Шай. "Основное преимущество безвирусного подхода к генной инженерии в том, что мы не так ограничены стоимостью, сложностью производства и проблемами цепочки поставок".

В 2015 году группа Марсона впервые показала, что можно вводить короткие ДНК-шаблоны в иммунные клетки без вирусных векторов, используя электрическое поле. К 2018 году они разработали метод вставки более длинных последовательностей ДНК в иммунные клетки с помощью CRISPR.

Затем, в 2019 году, исследователи обнаружили, что, используя модифицированную версию ДНК-шаблонов, способных связываться с ферментом Cas9, они могут доставлять новые последовательности в целевой участок генома эффективнее.

Однако для повышения выхода успешно модифицированных иммунных клеток и совместимости процесса с производством будущих клеточных терапий требовалась дополнительная работа. Эти цели мотивировали текущее исследование команды.

ДНК может существовать в одно- или двухцепочечной форме, а Cas9 присоединяется к двухцепочечной ДНК. Исследователи быстро обнаружили, что высокие уровни двухцепочечного ДНК-шаблона токсичны для клеток, поэтому метод можно было использовать только с малыми количествами шаблона, что приводило к низкой эффективности.

Команда знала, что одноцепочечная ДНК менее токсична для клеток даже при относительно высоких концентрациях. Поэтому в новой работе они описывают метод присоединения модифицированного фермента Cas9 к одноцепочечному ДНК-шаблону, добавляя лишь небольшой двухцепочечный "хвост" на концах.

"Это даёт нам сбалансированный подход, сочетающий лучшее из обоих миров", — говорит Марсон.

Одноцепочечный ДНК-шаблон более чем вдвое повысил эффективность редактирования генов по сравнению со старым двухцепочечным подходом. А двухцепочечные концы молекул позволяют исследователям использовать Cas9 для усиления доставки безвирусных векторов в клетки.

"Эта технология может сделать новые клеточные и генные терапии быстрее, лучше и дешевле", — говорит Джонатан Эсенстен, соавтор работы.

Путь в клинику

В исследовании учёные использовали новый ДНК-шаблон для генерации более миллиарда CAR-T-клеток, нацеленных на множественную миелому. CAR-T-клетки — это иммунные T-клетки, генетически модифицированные для эффективной борьбы с определёнными клетками или раком. С новыми одноцепочечными шаблонами, направляемыми Cas9, примерно половина всех T-клеток приобрела новый ген и, как следствие, превратилась в CAR-T-клетки.

"Мы знали, что нацеливание ДНК-шаблонов на специфическое место в геноме, называемое сайтом TRAC, улучшит противоопухолевую эффективность CAR-T-клеток", — говорит Джастин Экем, соавтор статьи. "Этот новый безвирусный подход позволяет нам достичь этого нацеливания гораздо эффективнее, что ускорит разработку следующего поколения CAR-T-клеточных терапий".

Кроме того, исследователи показали, что их подход может впервые полностью заменить два гена, связанных с редкими генетическими иммунными заболеваниями, — гены IL2RA и CTLA4.

Ранее учёные могли заменять небольшие участки гена IL2RA, где есть мутации у конкретных пациентов. Теперь команда Марсона доказала, что может заменить целиком гены IL2RA и CTLA4 за один раз — подход "один размер для всех", который мог бы лечить многих пациентов с разными мутациями в этих генах, вместо создания персонализированных шаблонов для каждой мутации. Почти 90% клеток, обработанных этим методом генной инженерии, получили здоровые версии генов.

Исследователи сейчас стремятся получить одобрение для продвижения клинических испытаний с использованием безвирусной технологии CRISPR как в CAR-T-клеточной терапии, так и в лечении дефицита IL2RA.