Разработан быстрый метод нокаута генов в Arabidopsis thaliana
Биологи из Института трансформативных биомолекул (ITbM) Университета Нагои сообщили в журнале Plant and Cell Physiology о разработке нового вектора (носителя для переноса генетической информации) для высокоэффективного и наследуемого нокаута целевых генов в модельном растении Arabidopsis thaliana.
Эффективность индуцирования мутаций системой CRISPR/Cas9 в Arabidopsis thaliana до сих пор оставалась относительно низкой, так как триггер для мутации гена активируется на более поздних стадиях развития клеток.
Новый вектор pKIR
Исследователи использовали промотор гена RIBOSOMAL PROTEIN S5A (RPS5A), который экспрессируется с ранней эмбриональной стадии в растительных клетках. Это позволило индуцировать белок Cas9 для нокаута генов в яйцеклетках с высокой эффективностью. Новый инструмент назвали вектором pKAMA-ITACHI Red (pKIR).
Повышенная эффективность
Когда для экспрессии Cas9 в Arabidopsis thaliana использовали общепринятый промотор 35S, частые нокауты генов наблюдались в листьях, но лишь немногие — в цветках. Это означало низкую эффективность мутации в репродуктивных клетках и сложности с передачей мутации следующему поколению.
Вектор pKIR, экспрессирующий Cas9 на стадии яйцеклетки и раннего развития, решает эту проблему. Поскольку яйцеклетки и зиготы — это начало развития растения, редактирование генома на ранней стадии приводит к высокой частоте мутаций, которые наследуются.
Экспериментальное подтверждение
- Нокаут гена PDS3: Этот ген отвечает за синтез хлорофилла. Его нокаут с помощью pKIR привёл к появлению альбиносного растения с белой окраской. Количество хлорофилла в цветоносе при использовании pKIR резко снизилось, в отличие от слабого эффекта с промотором 35S.
- Нокаут других генов: pKIR также успешно
нокаутировал гены, вовлечённые в развитие цветка и сперматозоидов:
- AGAMOUS (AG): Нокаут привёл к высокой частоте появления "цветка в цветке" (двойного цветка).
- DUO1: Нарушилось деление генеративной клетки и образовалась нефертильная спермоподобная клетка.
- Нокаут гена ADH1: Этот ген кодирует фермент, превращающий аллиловый спирт в токсичный для растений акролеин. Высокочастотный нокаут ADH1 с помощью pKIR привёл к тому, что мутанты выжили, в то время как дикий тип и гетерозиготные растения погибли.
Поскольку все особи второго поколения показали одинаковую картину мутации, это указывает, что редактирование генома произошло на ранней стадии развития (в яйцеклетках первого поколения). Для удобства идентификации семена, содержащие Cas9, помечены красной флуоресценцией.
Перспективы метода
Метод pKIR позволяет эффективно исследовать кластеры генов с перекрывающимися функциями, создавая мутанты быстрее и с меньшими затратами по сравнению с традиционным скрещиванием. Исследователи надеются улучшить метод для повышения эффективности мутагенеза и применения для редактирования генома сельскохозяйственных культур, таких как Brassica napus.