Вычислительный процесс сокращает десятилетия исследований биологии болезней до нескольких дней
Концентрация протонов, или pH, оказывает огромное влияние на всё, что делает клетка. На микроскопическом уровне pH-зависимые структуры регулируют движение и деление клеток. Нарушение pH-ответа может ускорять развитие рака и нейродегенеративных заболеваний, таких как болезни Альцгеймера и Хантингтона.
В новом исследовании, опубликованном в Science Signaling, исследователи из Университета Нотр-Дам представили вычислительный процесс, который может сканировать сотни белков за несколько дней, выявляя pH-чувствительные белковые структуры.
«Прежде чем взять пипетку или поставить эксперимент, мы можем предсказать, какие белки чувствительны к изменениям pH, какие белки фактически управляют критическими процессами, такими как деление, миграция, развитие рака и нейродегенеративных заболеваний», — сказала Катарин Уайт, доцент кафедры химии и биохимии.
Традиционные проблемы в идентификации pH-чувствительных белков
Определение того, как изменения pH влияют на поведение белков на молекулярном уровне, было сложной задачей, поскольку исследователям приходилось кропотливо тестировать индивидуальные белки в сигнальном пути на pH-чувствительность один за другим.
Например, ремоделирование актинового цитоскелета, ключевой аспект миграции клеток, было показано как pH-зависимое в 1993 году. С тех пор в этой области было охарактеризовано только четыре pH-чувствительных белка из многих подозреваемых в участии в процессе. В биологии в целом подтверждено только 70 цитоплазматических белков как pH-чувствительных, и для только 20 из них известны молекулярные механизмы.
Как работает новый вычислительный конвейер
Новое исследование разработало и подтвердило модульный вычислительный конвейер, который предсказывает расположение pH-чувствительных структур на основе существующих структурных и экспериментальных данных.
«Их внутренний pH — важная характеристика клеток, но её в значительной степени игнорировали из-за трудностей измерения и манипулирования», — сказал Даниэль ДиМайо, заместитель директора Йельского онкологического центра.
В процессе разработки конвейера исследовательская группа Уайт предсказала и подтвердила pH-чувствительность отличительного связывающего модуля, известного как домен Src homology 2 (SH2), который присутствует в белках, критически важных для передачи сигналов в клетке, иммунного ответа и развития, а также pH-зависимую функцию c-Src — интенсивно изучаемого фермента, который активируется при многих раках.
«Мы смогли сжать 25 лет работы в несколько недель», — объяснил Папа Кобина Ван Дайк, ведущий автор исследования.
Сбор данных и моделирование взаимодействий зарядов белка
Исследователи получили структурные данные из RCSB Protein Data Bank (PDB), глобального репозитория трёхмерных структур белков, нуклеиновых кислот и других биологических макромолекул.
Программа затем интегрирует экспериментальные значения pKa, которые оценивают значение pH, при котором конкретная аминокислота может получить или потерять протон. Эти значения позволяют программе предсказывать электрический заряд участков по всему белку и моделировать, как взаимодействия между зарядами влияют на форму белка.
«Мы смогли посмотреть, как все эти заряды связаны друг с другом», — сказала Уайт. «Аминокислоты, на которых мы сосредоточились, были теми, где переключение на противоположный заряд вызывало каскад переключения зарядов по всей сети».
Раскрытие аллостерических механизмов и регуляции белка
Последствия переключения заряда всего одной аминокислоты могут иметь огромное влияние, как в случае SHP2 — сигнального белка-фосфатазы, исследованного в новой работе. Хотя SHP2 был показан как pH-чувствительный в 2005 году, конкретный молекулярный механизм не был выяснен — до сих пор. При связывании протонов с двумя ключевыми остатками конформация всего белка из 593 аминокислот меняется с закрытой на открытую.
«Это механизм в биохимии, который называется аллостерией», — объяснила Уайт. «Аллостерия — это косвенный эффект, что-то, что происходит вдали от активного сайта белка, но регулирует активность. Наш конвейер может это сделать».
Изучая SHP2, исследовательская группа заметила, что два участка, отмеченные конвейером как pH-чувствительные, расположены на границе раздела двух ключевых структур, включая регуляторный SH2-домен. SH2-домены функционируют как молекулярный мост, облегчая сборку белковых комплексов, которые активируют клеточные ответы, такие как рост, дифференцировка, выживание и иммунная активация.
«Мы начали думать: что, если это механизм, общий для всех белков, содержащих SH2-домен?» — сказал Ван Дайк.
Последствия для рака и таргетной терапии
Конвейер выявил ряд SH2-сигнальных белков, которые содержат те же pH-чувствительные участки на границе SH2, что и SHP2. Среди них был c-Src. Вычислительный анализ Src выявил четыре потенциальных pH-чувствительных участка, которые затем были подтверждены экспериментально.
Исследователи обнаружили, что нормальный, здоровый Src имеет высокую активность при низком pH и низкую — при высоком pH. Раковые мутации в pH-чувствительных участках, отмеченных компьютером, делают белок нечувствительным к изменению pH, отменяя регуляцию активности Src и способствуя неконтролируемой пролиферации клеток, характерной для агрессивных раков.
Теперь, когда Уайт и коллеги картировали и подтвердили точный молекулярный механизм pH-регуляции в Src, открывается дверь для разработки таргетных препаратов, которые имитируют ключевые аллостерические сайты и восстанавливают естественную pH-чувствительность.
«Если вы можете понять молекулярный механизм, то вы можете нацелиться на него, воздействовать на него и уменьшить негативные эффекты этих мутаций у пациентов», — сказала Уайт.
В случае Src и SHP2 такие препараты были бы селективны только к мутантному белку, оставляя нормальный белок нетронутым и сохраняя активность в здоровых клетках пациента. Польза таких таргетных методов лечения выходит за рамки онкологии.
«Помимо рака и нейродегенерации, динамика pH связана с диабетом, аутоиммунными расстройствами и черепно-мозговой травмой», — сказала Уайт. «Наш конвейер — мощный инструмент для понимания и, в конечном итоге, разработки методов лечения этих состояний, с потенциалом преобразовать область».