Стратегия для уточнения генетических базовых редакторов
Ученые из Университета Райса разработали стратегию, позволяющую избежать ошибок в редактировании генов путем точной настройки конкретных стратегий CRISPR-базового редактирования заранее.
Химический и биомолекулярный инженер Сюэ Шерри Гао и химик Анатолий Коломейский объединили теорию и эксперименты для создания подхода к разработке более совершенных базовых редакторов — молекулярных машин, которые находят и исправляют дефектную ДНК с разрешением на уровне одного нуклеотида.
Исследование опубликовано в Nature Communications.
Работа описывает молекулярные процессы, которые базовые редакторы используют для манипуляции цепями ДНК, разрезая их там, где необходимо, и прокладывая путь для замены кода. Когда система работает (как при лечении генетических заболеваний, таких как серповидноклеточная анемия и некоторые виды рака), редактор редактирует только целевой нуклеотид.
Когда этого не происходит, причиной являются побочные (bystander) редактирования соседних нуклеотидов, которые могут вызвать нежелательные эффекты.
Стратегия Райса в первую очередь направлена на устранение этих ошибочных редактирований "соседей". Лаборатория Гао ранее представила инструменты для повышения точности CRISPR-редактирования мутаций цитозина до 6000 раз.
Для нового проекта она привлекла лабораторию Коломейского, чтобы помочь создать теоретическую основу для исключения метода проб и ошибок при разработке библиотеки редакторов. Это позволило бы лучше нацеливаться на мутации, вызывающие заболевания, избегая побочных эффектов. В процессе эта основа может помочь ученым лучше понять химические и физические процессы, происходящие во время базового редактирования.
"Шерри и другие экспериментальные ученые уже получили рабочие результаты", — сказал Коломейский, ссылаясь на предыдущую работу, в которой лаборатория использовала свой редактор для преобразования цитозинов в тимины, исправляя мутации ДНК и избегая при этом уязвимых цитозинов выше по цепи. "Но, несмотря на эти удивительные разработки, не было микроскопического понимания того, что нам нужно сделать с этими белковыми системами, чтобы улучшить редактирование".
Цянь Ван, бывший постдокторант в лаборатории Коломейского, а ныне доцент Научно-технического университета Китая (USTC), взялся за эту задачу, используя эксперимент Гао с цитозином в качестве базового.
"Мы применили модель к этому результату и получили некоторые важные параметры, которые затем использовали для проектирования того, какие мутации и где необходимы для получения точного редактирования", — сказал Коломейский. "В конечном счете, этот симбиоз теории и эксперимента позволяет нам работать разумно".
Их стратегия сочетает молекулярно-динамическое моделирование и стохастические модели, которые точно определяют энергии связывания между молекулами, необходимые для достижения максимальной селективности редактирования. Эксперименты в лаборатории Гао подтвердили результаты.
Критически важно, что эта структура включает способ охарактеризовать аффинность связывания между деаминазами — ферментами, катализирующими удаление аминогруппы из молекулы — и одноцепочечной ДНК (ssDNA).
В идеале деаминаза остается на ssDNA ровно столько времени, сколько необходимо для завершения основного редактирования, и высвобождается до того, как случайно отредактирует сайт-сосед.
"Важно то, что одна мутация не работает для разных систем", — сказал Коломейский. "Итак, для каждой системы эту процедуру нужно выполнять заново, но, по крайней мере, понятно, что должно быть сделано".
"Модель очень успешно отражает то, что уже было сделано экспериментально", — сказала Гао. "Но с тех пор нам удалось снизить побочные эффекты в других системах базового редактирования.
"Поскольку количество мутантов может исчисляться тысячами, экспериментаторам в одиночку нереально проверить каждый базовый редактор", — сказала она. "Только такой междисциплинарный подход позволит нам вычислительным путем построить огромную библиотеку редакторов, а затем сузить число до наиболее многообещающих кандидатов для дальнейших экспериментальных проверок. К этому мы и стремимся".