Учёные связали ооцит-специфичный гистон H1FOO с улучшенным получением iPS-клеток
Совместная исследовательская группа под руководством доктора Акиры Кунитоми, бывшего постдока в CiRA (ныне исследователя в Институте сердечно-сосудистых заболеваний Гладстона), и компании ID Pharma Co., Ltd., раскрыла ключевую роль ооцит-специфичного линкерного гистона H1FOO в повышении эффективности и однородности репрограммирования в "примированное" и "наивное" плюрипотентные состояния. Исследование опубликовано в Stem Cell Reports.
Обычное репрограммирование даёт индуцированные плюрипотентные стволовые (iPS) клетки человека с "примированными" характеристиками, напоминающими эпибласт после имплантации с ограниченным потенциалом превращения во внезародышевые ткани. "Наивное" плюрипотентное состояние проявляет свойства, более схожие с клетками эпибласта до имплантации и мышиными iPS-клетками, что позволяет им дифференцироваться как в эмбриональные, так и во внезародышевые линии.
Несмотря на достижения, главной проблемой iPS-клеток для исследований и медицины остаётся их гетерогенность. Традиционные методы репрограммирования — стохастический процесс, поэтому учёные ищут более эффективные и точные способы получения однородных iPS-клеток.
В новом исследовании команда изучила потенциал материнского линкерного гистона H1FOO как кандидата для улучшения репрограммирования. Исследователи сконструировали H1FOO, присоединив дестабилизирующий домен (DD), чтобы химически управлять его деградацией и точно регулировать уровни.
В комбинации с факторами Яманаки (OSKL, где MYC заменили на LMYC для избежания опухолеобразования) H1FOO-DD значительно повысил эффективность генерации iPS-клеток независимо от системы доставки генов.
Анализ экспрессии генов и эпигенетики не выявил существенных различий между репрограммированием только с OSKL и с добавлением H1FOO-DD. Однако он показал, что при использовании H1FOO-DD независимо полученные iPS-клетки демонстрировали более схожий профиль экспрессии генов, что указывает на улучшение однородности и воспроизводимости.
Анализ генов с высокой вариабельностью экспрессии между разными линиями iPS-клеток показал, что H1FOO снизил такую вариабельность почти вдвое. Многие из этих генов вовлечены в регуляцию экспрессии, что демонстрирует способность H1FOO-DD более строго направлять процесс репрограммирования.
Кроме того, iPS-клетки, полученные с H1FOO-DD, лучше дифференцировались в энтодерму (один из трёх зародышевых листков) и кардиомиоциты (мезодермальный тип клеток).
Исследуя механизмы, команда с помощью секвенирования РНК единичных клеток (scRNA-seq) обнаружила, что репрограммирование с H1FOO-DD не только вызывало более раннюю и высокую экспрессию генов плюрипотентности, но и подавляло экспрессию генов, связанных с врождённым иммунным ответом, воспалением и апоптозом.
В частности, H1FOO-DD увеличивал долю клеток, классифицированных как успешно репрограммированные, и уменьшал субпопуляции клеток с неполным или неудачным репрограммированием.
Поскольку H1FOO — фактор ремоделинга хроматина, исследователи также изучили доступность его регионов. В соответствии с анализом экспрессии генов, регионы хроматина, особенно рядом с маркерами плюрипотентности, открывались раньше и были более доступны при использовании H1FOO-DD.
Дальнейший анализ показал, что семейства транскрипционных факторов POU и KLF/SP активировались H1FOO-DD раньше в процессе репрограммирования. Это говорит о том, что H1FOO-DD помогает координировать репрограммирование более эффективно и своевременно.
Исследуя гены с дифференциальной экспрессией на ранних этапах репрограммирования, учёные выявили 19 повышенных и два пониженных гена при включении H1FOO-DD. Индивидуальный анализ показал, что сверхэкспрессия FKBP1A или APOE улучшает репрограммирование. Поскольку APOE уже был известен, внимание сосредоточили на FKBP1A.
Оказалось, что репрограммирование только с OSKL повышает экспрессию FKBP1A, но добавление H1FOO-DD драматически её усиливает. Это подтвердили повторным анализом данных по экспрессии генов и доступности хроматина.
FKBP1A — иммунофилин, участвующий в иммуносупрессии, который может взаимодействовать и ингибировать TGFBR1, что, в свою очередь, способствует мезенхимально-эпителиальному переходу (MET) и повышает эффективность репрограммирования.
Исследователи предположили, что именно функции FKBP1A в подавлении врождённого иммунитета и ингибировании опосредованного TGFBR1 MET ответственны за усиление эффективности репрограммирования с помощью H1FOO-DD.
Репрограммирование комбинацией OSKL и сверхэкспрессии FKBP1A приводило к сопоставимому подавлению TGFBR1, усилению MET, подавлению врождённого иммунного ответа и апоптоза, как и при использовании H1FOO-DD.
Наконец, поскольку ранний анализ показал, что H1FOO-DD также индуцирует экспрессию маркеров наивного состояния, учёные проверили его способность улучшать репрограммирование в наивное состояние. Действительно, включение H1FOO-DD существенно улучшило генерацию наивных iPS-клеток.
Аналогично примированному репрограммированию, H1FOO-DD усиливал процесс, координируя более однородную генную и эпигенетическую регуляцию в клетках. Функционально, по метаболической активности и реактивации X-хромосомы, репрограммирование с H1FOO-DD давало наивные iPS-клетки, более похожие на наивные эмбриональные стволовые клетки или преимплантационные бластоцисты, чем при использовании только OSKL.
Таким образом, совместные усилия выявили ось H1FOO-FKBP1A как средство для репрограммирования клеток с большей эффективностью и точностью. Эти открытия окажут значительное влияние на генерацию iPS-клеток как для фундаментальных исследований, так и для клинического применения.