Новое руководство по точной оценке размера генома растений с помощью проточной цитометрии
Исследователи из Университета штата Северная Каролина представили новое руководство для повышения точности оценки размера генома растений методом проточной цитометрии.
Несмотря на более чем 50-летнее использование проточной цитометрии для оценки относительных и абсолютных размеров генома растений, точность этих оценок может сильно варьироваться из-за множества факторов, включая ошибки в оценках размера генома референсных стандартов и различия в экспериментальных методах.
Данное исследование, опубликованное в Journal of the American Society for Horticultural Science, пересматривает устоявшиеся допущения, выявляет источники вариаций и устанавливает лучшие практики и обновлённые референсные стандарты для повышения точности оценок.
Ключевые факторы, влияющие на точность
В ходе пяти отдельных исследований были проанализированы основные источники ошибок:
Влияние флуорохромов (4′,6-диамидино-2-фенилиндол / DAPI и пропидий йодид / PI): Различия в окрашивании, предпочтения к парам оснований, время инкубации и эффективность окрашивания плотно упакованного хроматина могут приводить к значительным вариациям в оценках.
Влияние буферов: Для выделения и окрашивания ядер используется до 28 различных буферов, оптимизированных под конкретные ткани. Их состав (ПАВ, изотонические агенты, pH-буферы, связывающие фенолы вещества, соединения для сохранения ДНК, ферменты) критически важен.
Влияние метаболитов: Вторичные метаболиты растений (антоцианы, кофеин, хлорогеновая кислота, кумарины, эллаговая кислота, танины и др.) могут взаимодействовать с флуорохромами и ядерной ДНК, вызывая занижение или завышение оценки размера генома.
Влияние типа ткани: На оценку влияет орган-источник, состояние ткани (живая, мёртвая, фиксированная) и присутствие цитозольных соединений, которые могут создавать тканеспецифичные помехи.
Влияние референсных стандартов: Использование стандартов с устаревшими оценками размера генома вносило дополнительные ошибки. В исследовании были пересмотрены размеры геномов часто используемых растительных стандартов, с использованием лейкоцитов человека мужского пола в качестве первичного стандарта с обновлённым размером генома (6.15 пг; на 12.14% меньше, чем в более ранних работах).
Основные выводы и рекомендации
- Проточная цитометрия позволяет точно и воспроизводимо определять относительный размер генома и плоидность у близкородственных растений при использовании согласованных методов.
- Однако точное определение абсолютного размера генома остаётся сложной задачей. Такие оценки следует считать приблизительными, с потенциальной ошибкой ±29% и более, зависящей от экспериментальных методов и особенностей растения.
- Предоставлены конкретные рекомендации по лучшим практикам, включая использование обновлённых референсных стандартов.
Значение исследования: Точная оценка размера генома критически важна для селекции растений, генетического картирования и изучения биоразнообразия. Новые руководства и стандарты помогут повысить надёжность метода.
Цитата авторов: "Проточная цитометрия — чрезвычайно ценный инструмент... Однако, используя эту технологию десятилетиями, мы поняли, насколько эти оценки подвержены вариациям из-за методологии... В этом исследовании мы смогли переоценить размеры геномов стандартов, количественно определить источники ошибок и рекомендовать лучшие практики".