Улучшения в микроскопии приближают к неуловимым деталям биологии

Исследователи из Центра прикладных структурных открытий (CASD) и Школы молекулярных наук (SMS) Университета штата Аризона в составе международной коллаборации усовершенствовали технику криогенной электронной микроскопии (cryo-EM).

Метод cryo-EM включает мгновенную заморозку биологического образца, его визуализацию пучком электронов и сборку тысяч 2D-изображений в атомный профиль структуры с помощью компьютера. Такие карты плотности затем преобразуются в детальное 3D-изображение. Метод особенно полезен для выявления тонкостей структуры белка, которые часто упускаются при обычном моделировании.

Новое исследование описывает метод получения более точных структур с помощью сложного статистического метода, известного как максимальная энтропия. Этот подход идеально подходит для обработки данных cryo-EM, создавая наиболее объективную структурную модель биологического образца.

Сложные биомолекулы, такие как белки, существуют в ансамбле состояний и могут менять форму за наносекунды. Новая техника позволяет моделировать эти переходные структуры, которые играют жизненно важную роль в биологических процессах, но часто упускаются при использовании традиционных методов cryo-EM.

«Эта работа демонстрирует, как интеграция инструментов, разработанных лабораториями с дополнительным опытом, может использоваться в сочетании с экспериментальными данными для углубления нашего понимания структурной биологии», — сказал Альберто Перес из Университета Флориды.

Результаты группы опубликованы в журнале Matter (Cell Press) и представлены на его обложке.

Сильные стороны cryo-EM

Cryo-EM — один из трёх основных методов структурной биологии наряду с рентгеновской кристаллографией и спектроскопией ядерного магнитного резонанса (ЯМР). В то время как рентгеновская кристаллография может давать детальные структуры высокого разрешения, особенно с использованием лазеров на свободных электронах (XFEL), этот метод плохо подходит для визуализации крупных или сложных структур, таких как мембранные белки, поскольку их сложно кристаллизовать. То же верно и для ЯМР.

Визуализация крупных сложных биомолекул — это сильная сторона cryo-EM, поскольку образцы не требуют кристаллизации и могут изучаться в их естественной среде.

Новый подход: максимальная энтропия

Сложность возникает при попытке создать 3D-модель из сырых данных 2D-карты плотности молекулы. Ранее это предполагало обоснованное предположение о структуре и подгонку данных под эту модель. Неточности могли возникать из-за переобучения модели.

Новый подход не делает предположений о конечной молекулярной структуре, кроме известных с уверенностью ограничений. Создавая наиболее объективную структуру, этот подход с максимальной энтропией помогает исследователям заполнить пробелы при определении структуры, лучше учитывая вклад различных конформаций, которые могут существовать с очень низкой частотой.

Для визуализации: представьте мальчика, который стоит неподвижно час, за исключением редких, кратковременных движений рук и ног. В среднем ничего не меняется, и модель мальчика будет статичной. Подход максимальной энтропии, напротив, позволит всем различным жестам, сколь бы кратковременными они ни были, внести вклад в итоговое изображение, давая более точное представление.

В новом исследовании представлены шесть примеров сложно упакованных белков разного размера, включая крупные мембранные и мультидоменные системы. Результаты подчёркивают способность статистического пакета максимальной энтропии CryoFold обнаруживать молекулярные ансамбли, включая редкие низковероятные структуры, которые были экспериментально подтверждены и признаны функционально значимыми.

Метод максимальной энтропии можно использовать совместно с существующими методами подгонки данных в итеративном процессе, способном превращать данные низкого разрешения в высококачественные 3D-структуры с высокой степенью достоверности.

«Эта работа объединяет несколько подходов на основе физики для уточнения структур белков из данных cryo-EM, предоставляя не единое статичное изображение белка, а скорее коллекцию структур, что более репрезентативно отражает истинную, динамичную природу белков», — сказал Читрак Гупта, соавтор и исследователь в CASD и SMS.