Сенсор с ДНК-штрихкодом: нанозонд для детекции активных протеаз

Протеазы — ферменты, расщепляющие белки — играют ключевую роль во многих физиологических процессах. Обычно они присутствуют в неактивном состоянии и активируются при определённых условиях. Некоторые из них связаны с заболеваниями, такими как инфекции или рак, что делает важным создание методов для селективного обнаружения активных протеаз.

В статье, опубликованной в журнале Angewandte Chemie International Edition, учёные представили новый класс сенсоров активности протеаз: золотые наночастицы, оснащённые пептидно-ДНК конструкциями.

Команда под руководством Девлины Саманты и Анны Капассо (Техасский университет в Остине, США) показала, что эти нанозонды могут обнаруживать несколько активных протеаз параллельно (мультиплексный анализ). Метод работает при комнатной температуре и не требует сложной пробоподготовки или громоздкого оборудования.

В основе новых зондов — золотые наночастицы, к которым прикреплены цепи, состоящие из пептида и фрагмента ДНК. Структура пептида подобрана так, чтобы его расщепляла целевая протеаза. ДНК действует как уникальный штрихкод для идентификации пептида и одновременно усиливает сигнал. Если в образце присутствует нужная протеаза в активной форме, она расщепляет пептид. Это высвобождает ДНК-штрихкод в раствор, где его можно детектировать по последовательности.

Для детекции команда использует CRISPR/Cas12a тест: фермент Cas12a связан с направляющей РНК (gRNA), образуя неактивный комплекс. gRNA содержит сегмент, специфично связывающийся с ДНК-штрихкодом. Это активирует Cas12a, и он начинает расщеплять одноцепочечную ДНК (ssDNA).

Для теста исследователи добавляют молекулы ssDNA, на одном конце которых находится флуоресцентная метка (флуорофор), а на другом — гаситель (quencher), который «гасит» флуоресценцию, пока они находятся близко друг к другу. Если ssDNA расщепляется, флуорофор и гаситель расходятся, что приводит к сильной флуоресценции, указывающей на присутствие целевой протеазы (предел обнаружения около 58 pM).

Если приборы недоступны и нужен быстрый результат, детекция возможна невооружённым глазом: если протеаза расщепляет пептид на зонде, поверхностный заряд золотых наночастиц меняется, и они агрегируют. Цвет этих «плазмонных наноструктур» сильно зависит от степени агрегации. Изменение цвета тестового раствора позволяет обнаруживать наномолярные концентрации протеаз.

Мультиплексное обнаружение протеаз 3CL и каспазы-3 продемонстрировало высокую чувствительность и селективность нового метода. 3CL — маркер активной коронавирусной инфекции, а у пациентов с COVID часто повышена активность маркера апоптоза каспазы-3. Клинический потенциал теста также показан на примере детекции катепсина B — протеазы, связанной с колоректальным раком, в трёх различных опухолевых клеточных линиях, полученных от пациентов.

Эти нанозонды дают в 100 раз более сильный флуоресцентный сигнал по сравнению с коммерческими флуоресцентными сенсорами протеаз. Более того, можно обнаружить практически любую протеазу, если известен расщепляемый ею пептид. В совокупности эти нанозонды потенциально могут обеспечить раннее выявление заболеваний и повысить точность и надёжность диагностических тестов за счёт мультиплексирования.