Впервые измерена в реальном времени важная сигнальная молекула в клетках человека

Учёным впервые удалось провести измерения изменений концентрации важной сигнальной молекулы — оксида азота (NO) — в клетках человека в реальном времени. Прорыв, опубликованный в журнале Nature Communications, был достигнут путём слияния двух специальных белков, которые выступили в роли измерительного зонда. Полученный химерный белок может быть генетически закодирован и, таким образом, производиться непосредственно в исследуемых клетках. Это открывает путь к совершенно новым представлениям о динамике NO, играющего важную роль в сердечно-сосудистой, нервной и иммунной системах.

Флуоресцентный белок

Команда создала флуоресцентный белок, свечение которого меняется при связывании с NO. Изменение флуоресценции зависит от концентрации NO, процесс обратим и происходит практически в реальном времени. Это позволяет напрямую измерять внутриклеточную динамику NO. Исследователи из Медицинского университета Граца под руководством Роланда Малли успешно измерили эту динамику в различных типах клеток, которые были генетически модифицированы для самостоятельной выработки нового белка.

Создание химеры

Ключом к успеху стали белки, специфично связывающие NO. «Мы решили сшить такой NO-связывающий белок с естественно флуоресцентным белком. То есть создать химерный новый белок, способный и связывать NO, и флуоресцировать», — объясняет Малли. Компьютерное моделирование подтвердило, что это возможно для особой комбинации белков.

Конструктор из белков

Основываясь на симуляции, команда создала несколько новых белков. NO-связывающий компонент во всех них был взят из бактериального белка NorR — транскрипционного фактора. «Вероятность того, что это окажет малое влияние на клетки млекопитающих, в которых мы хотели измерить NO, была очень высока», — отмечает Малли. Часть NorR, ответственную за связывание NO, объединили с пятью разными флуоресцентными белками. Полученные химерные белки, названные «генетически кодируемыми NO-зондами» (geNOps), успешно производились клетками после введения соответствующей генетической информации.

Эффективный метод

Эффективность различных geNOps оказалась высокой: связывание NO приводило к гашению (quenching) флуоресценции. Интенсивность эффекта напрямую зависела от концентрации NO, а связывание было легко обратимым, что позволило быстро измерять изменения клеточной концентрации NO.

Запатентованная технология

С помощью geNOps учёные смогли измерить концентрацию NO в клеточных компартментах, например, в митохондриях. Кроме того, комбинируя geNOps с измерениями концентрации кальция, они продемонстрировали взаимосвязь между активностью сигнальных молекул NO и кальция с высоким временным разрешением. Разработка geNOps, уже запатентованная и поддержанная Австрийским научным фондом FWF, знаменует новую эру в измерении оксида азота и его широкого физиологического воздействия на уровне отдельных клеток.