Микрокристаллы могут произвести революцию в структурной биологии

Для структурных биологов самый сложный этап в определении точной молекулярной структуры белка — получение упорядоченных трёхмерных кристаллов, необходимых для большинства структурных исследований. В особо трудных случаях на это могут уйти годы, а иногда белок так и не кристаллизуется. Учёные из Медицинского института Говарда Хьюза (HHMI) разработали новый метод, позволяющий получить высокоразрешающую структуру белка из кристаллов, в миллион раз меньших, чем требуется для рентгеновской кристаллографии.

Новая техника, названная MicroED (микроэлектронная дифракция), может ускорить работу структурных биологов и расширить список белков, для которых можно определить структуру с высоким разрешением. «Биохимически получить мелкие кристаллы всегда проще», — говорит структурный биолог Тамир Гонен, разработавший метод вместе с коллегами из исследовательского кампуса Janelia Farm HHMI.

Метод MicroED описан в статье, опубликованной 19 ноября 2013 года в открытом журнале eLife. Учёные могут использовать электроны электронного микроскопа для определения структуры белковых микрокристаллов. Этот подход, известный как электронная кристаллография, ранее был ограничен исследованиями белков, способных образовывать очень тонкие двумерные кристаллы.

Проблема в том, что излучение высокоэнергетического электронного пучка микроскопа быстро разрушает белковые кристаллы. Кристаллы выдерживают всего два-три воздействия «низкодозового» луча, а для определения структуры требуется гораздо больше дифракционных картин. Это вынуждало собирать и анализировать данные с тысяч разных кристаллов, что для трёхмерных кристаллов было непреодолимой задачей.

Гонен, специалист по микроскопии Дан Ши и их коллеги решили упростить обработку данных, собирая множество дифракционных картин с одного кристалла. Для этого им пришлось радикально снизить дозу электронов от микроскопа — примерно в 200 раз меньше, чем обычно считается низкой дозой.

Для проверки идеи постдок Брент Нанненга вырастил очень мелкие кристаллы белка лизоцима с известной структурой. Микрокристаллы, выглядящие как мельчайшие точки под световым микроскопом, нанесли на углеродную сетку. Поместив сетку в микроскоп, её запрограммировали на вращение на один градус с записью дифракционной картины после каждого поворота. Было собрано 90 градусов данных.

Аспирант Мэтт Иаданца разработал программное обеспечение для индексации и интеграции 90 дифракционных картин, что позволило команде получить полную структуру лизоцима. Для улучшения качества структуры процесс повторили для ещё двух кристаллов в разных ориентациях и объединили данные.

Полученная структура совпала с известной структурой лизоцима с разрешением 2.9 ангстрема. «Это именно тот уровень, который нужен для биологических белков», — говорит Гонен. Дальнейшее совершенствование программ обработки данных позволит улучшить разрешение метода MicroED. Данные уже собраны с разрешением до 1.7 ангстрема.

Команда Гонена совместно с Эндрю Лесли из Лаборатории молекулярной биологии Совета по медицинским исследованиям работает над интеграцией обработки данных MicroED в стандартное ПО для рентгеновской кристаллографии (MOSFLM), чтобы сделать метод более доступным. Многие лаборатории уже привезли свои белковые микрокристаллы в Janelia для исследования.

«Существует большой ажиотаж, потому что у многих людей есть микрокристаллы, о которых они даже не подозревают, — говорит Гонен. — Мы обнаружили, что в капле для кристаллизации, где есть крупные кристаллы, всегда присутствуют и микрокристаллы. И даже если вы не видите кристаллов под световым микроскопом, это не значит, что микрокристаллов нет».