Новый метод микроскопии на основе микрофабрикации

Исследователи из Института механобиологии Национального университета Сингапура разработали усовершенствованную технику SPIM, требующую всего одного объектива, под названием soSPIM. Цель — создать простой, но универсальный метод микроскопии для идентификации отдельных белков в любой части клетки и оценки клеточной организации в 3D.

Потребность в 3D-визуализации сверхвысокого разрешения

Несмотря на прогресс в области микроскопии сверхвысокого разрешения, лишь немногие методы, такие как полное внутреннее отражение флуоресценции (TIRF) и интерферометрическая микроскопия локализации с фотоактивацией (iPALM), позволяют визуализировать отдельные молекулы. Эти методы ограничены получением 2D-изображений у поверхности покровного стекла или 3D-изображений в пределах первого микрометра (μm) от него. Типичная клетка кожи человека имеет высоту 30 μm.

Селективная плоскостная микроскопия (SPIM) — это метод, позволяющий проводить 3D-визуализацию более толстых образцов на уровне одной клетки. Он избирательно освещает одну плоскость образца, направляя сфокусированный световой лист сбоку, в то время как флуоресцентный сигнал регистрируется через второй объектив, расположенный перпендикулярно листу. 3D-изображение реконструируется из собранных изображений отдельных срезов клетки. Однако этот подход требует сложной системы с двумя объективами и специального держателя образца, что делает его несовместимым со стандартными микроскопами.

Принцип работы soSPIM

Новая техника soSPIM, разработанная доцентом Виржилем Вьяснофф из MBI и CNRS (Франция), использует массив микрозеркальных лунок, созданных методом микрофабрикации. Каждое зеркало, наклоненное ровно на 45°, служит как для направления возбуждающего луча, так и для удержания образца. Вместе с дополнительным модулем управления лучом эти микрозеркала позволяют как возбуждающему лучу, так и флуоресцентному сигналу, наблюдаемому через микроскоп, проходить через один стандартный объектив.

Метод soSPIM продемонстрировал быстрый отклик и хорошую разрешающую способность для 3D-визуализации всей клетки на высоте до 30 μm над покровным стеклом. Он также смог идентифицировать отдельные белки глубоко внутри клетки.

Преимущества и перспективы

Поскольку микрофабрицированное зеркало и держатель образца производятся независимо от микроскопической системы, эта техника совместима со стандартными инвертированными микроскопами и объективами с высокой числовой апертурой и иммерсией. Это предоставит большему числу исследователей возможность наблюдать за активностью отдельных белков на их существующих микроскопических системах.

Нарушение регуляции белков может привести к изменениям в любой части или процессе внутри клетки. Возможность увидеть эти изменения крайне важна для полного понимания причин возникновения определенных патологических состояний. Это означает возможность визуально наблюдать всю клетку во всех трех измерениях, а также на уровне отдельных молекул. Разработка метода soSPIM не только делает эти задачи достижимыми, но и реализует их с использованием стандартной технологии инвертированного микроскопа.