Поиск сердцебиения клеточных сетей
Молекулы в наших клетках образуют сложную сеть взаимодействий. Однако современные методы позволяют измерять лишь отдельные молекулярные реакции вне клеток. Поскольку концентрации молекул в клетках намного выше, чем в лабораторных условиях, учёные предполагают, что кинетика молекулярных реакций в живых клетках существенно отличается от данных внешних проб.
«Мы ожидали, что скорость реакции в клетке будет выше, — подтверждает биофизик LMU профессор Дитер Браун. — Однако наш новый оптический подход показал, что — в зависимости от длины цепей — связывание цепей ДНК внутри живых клеток может быть как быстрее, так и медленнее, чем снаружи». Данные, полученные из живых клеток, чрезвычайно ценны для разработки моделей, понимания сложных взаимодействий и патологических процессов в биологических клетках. Браун и его команда теперь планируют исследовать различные молекулярные реакции в живых клетках, визуализируя «сердцебиение» клеточных сетей (PNAS online, 14 ноября 2009).
В своей работе учёные исследовали гибридизацию — связывание и разъединение — двух цепей ДНК, которые они ввели в живые клетки. Для определения константы времени реакции они использовали инфракрасный лазер для индукции температурных колебаний разной частоты в клетке и измеряли концентрацию партнёров по реакции, а именно связанных и разъединённых цепей ДНК. При низких частотах эти концентрации следовали за температурными колебаниями, тогда как при более высоких частотах они испытывали фазовую задержку и колебались с уменьшенной амплитудой. И время задержки, и уменьшение амплитуды были оценены для получения константы времени реакции.
Команда определяла концентрации с помощью флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET), который происходит между двумя хромофорами на определённом расстоянии. Они присоединили пару FRET к цепям ДНК таким образом, что перенос энергии происходил только в случае связывания цепей. Хромофоры возбуждали стробоскопической лампой, а ПЗС-камера регистрировала время и амплитуду флуоресценции, визуализируя изменения концентрации с пространственным разрешением около 500 нанометров. Эксперименты показали, что цепи ДНК, состоящие из 16 единиц (так называемых оснований), демонстрировали семикратно более высокую скорость реакции по сравнению со значениями, определёнными вне живых клеток.
Цепи ДНК из 12 оснований, напротив, реагировали в пять раз медленнее, чем вне клеток. Это удивительный результат, поскольку предполагалось, что кинетика молекулярных реакций в клетках, где преобладают гораздо более высокие концентрации молекул, всегда выше. «По-видимому, клетки модулируют скорость реакции высокоизбирательным образом, — говорит Браун. — Измерения дают ценное представление о кинетических данных in vivo для систематического анализа сложности биологических клеток», — добавляет Ингмар Шён, проводивший сложные эксперименты. Учёные теперь планируют исследовать широкий спектр молекулярных реакций в живых клетках, визуализируя сердцебиение клеточных сетей.