Инженерия искусственных клеточных мембран для запуска образования фибринового гидрогеля in situ
Перепроектирование клеточной мембраны для улучшения биофункциональности — это новый мощный инструмент в клеточной биологии для разработки терапий следующего поколения. Оно позволяет наделять клетки дополнительными терапевтическими функциями, такими как направленная миграция, адгезия к поверхности или устойчивость к гипоксии. Однако примеров реинжиниринга плазматических мембран для активации мембраносвязанных ферментов, способствующих сборке белков внеклеточного матрикса (ECM), ограничено.
В недавнем исследовании Роберт К. Деллер и его коллеги из Великобритании создали автономную систему формирования клеточного матрикса. Они модифицировали плазматическую мембрану человеческих мезенхимальных стволовых клеток (hMSCs), интегрировав в неё новую конструкцию тромбина. Это привело к спонтанному зарождению и росту фибринового гидрогеля при добавлении в культуральную среду фибриногена в концентрациях, соответствующих человеческой плазме.
Учёные сконструировали клеточную мембрану, синтезировав суперкатионный комплекс тромбин-полимерный сурфактант, связывающийся с мембраной. В получившихся прочных фибриновых гидрогелевых конструктах, содержащих стволовые клетки, наблюдалась дифференцировка клеток в остеогенные и адипогенные линии. Дифференцированные клетки могли в итоге секретировать фибрин, формируя самоподдерживающиеся биоинженерные клеточные монолиты с модулем Юнга, характерным для нативного внеклеточного матрикса. Результаты опубликованы в Nature Communications.
Контекст и проблема
Рациональный дизайн матриксов (скаффолдов) для клеточной терапии крайне сложен, поскольку фенотип и судьба клеток зависят от множества факторов: адгезии клеток, химического состава окружения, стимуляции рецепторов, микро-/наноморфологии поверхности и механической жёсткости. В тканевой инженерии in vitro клетки обычно засевают на биосовместимые и биодеградируемые скаффолды, которые служат заменой ECM. По мере роста и дифференцировки клетки производят собственный естественный ECM, постепенно замещая искусственный материал.
Среди натуральных биосовместимых полимеров для создания таких временных гидрогелевых скаффолдов популярен фибрин, так как его можно легко получить при комнатной температуре путём протеолитического расщепления. Фибриновые гидрогели могут опосредовать клеточные функции и регулировать дифференцировку стволовых клеток, например hMSCs.
Метод и результаты
Синтез комплекса: Учёные разработали двухэтапный процесс для создания активной суперкатионной конструкции тромбина (sc_thrombin). Также был создан вариант с полимерной сурфактантной короной — sc_thrombin[ox890] (где ox890 — гликолевый эфир 4-нонилфенола). Реакцию контролировали по pH, температуре и составу, отслеживая её ход с помощью потенциометрии в течение двух часов. Активность тромбина подтверждали по увеличению мутности раствора фибриногена. Полную катионизацию конструкции показали с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF.
Связывание с мембраной и рост гидрогеля: Монослой hMSCs инкубировали с флуоресцентно мечеными аналогами тромбина. С помощью конфокальной микроскопии в режиме реального времени подтвердили связывание тромбина с плазматической мембраной и показали зарождение и рост фибрина непосредственно от клеток.
Биосовместимость и жизнеспособность: Анализы роста клеток показали отсутствие наблюдаемой цитотоксичности у модифицированных hMSCs в широком диапазоне концентраций тромбина (от 1 µM до 25 mM). Конфокальная микроскопия продемонстрировала формирование 3D фибринового гидрогелевого конструкта с плотными клеточными агрегатами, окружёнными фибриновым матриксом.
Дифференцировка клеток: Учёные исследовали способность системы поддерживать долгосрочный рост 3D-культур и дифференцировку hMSCs по адипогенному и остеогенному путям. Результаты подтвердили с помощью биомеханических тестов и анализа методом ОТ-ПЦР (RT-PCR) экспрессии генов SOX9 (хондрогенез) и RUNX2 (остеогенез). Модуль Юнга полученных самоподдерживающихся структур был сопоставим с таковым у мягких фибриновых гидрогелей.
Исследование in vivo: Для предварительных исследований трансплантации клеток использовали модель рыбки данио (Danio rerio). Первичные фибробласты данио метили флуоресцентной меткой и конъюгатом sc_thrombin[ox890], после чего вводили микроинъекцией в место разреза. Через 3 дня клетки оставались жизнеспособными. Макроскопические и гистологические анализы не выявили неблагоприятных эффектов от введения модифицированных фибробластов по сравнению с нативными.
Выводы и перспективы
Деллер и его коллеги создали и охарактеризовали новую мембрано-активную конструкцию тромбина и показали её применение для запуска образования фибрина in situ на плазматических мембранах стволовых клеток. Полученные фибриновые гидрогелевые конструкты поддерживали высокий уровень роста и жизнеспособности клеток, приводя к формированию самоподдерживающейся ткани. Стволовые клетки успешно дифференцировались по известным путям.
Авторы предлагают оптимизировать протоколы для дальнейших экспериментов in vitro перед переходом к исследованиям in vivo, чтобы глубже понять ферментативную активность биоинженерных белков, связанных с клеточной мембраной, и разработать биосовместимые гемостатические продукты.