Прорывный инструмент генетического скрининга для органоидов человека
Многие фундаментальные принципы биологии и практически все пути регуляции развития были идентифицированы в так называемых генетических скринингах. Впервые разработанные на плодовой мушке Drosophila и нематоде C. elegans, такие скрининги предполагают инактивацию множества генов по одному. Анализируя последствия потери гена, учёные могут делать выводы о его функции. Таким образом можно, например, идентифицировать все гены, необходимые для формирования мозга.
Генетические скрининги рутинно проводятся на мушках и червях. У человека существует обширный объём знаний о генетических нарушениях и последствиях болезнетворных мутаций, но их систематический анализ был невозможен. Теперь лаборатория Кноблиха в IMBA разработала прорывную методику, позволяющую анализировать сотни генов параллельно в человеческой ткани. Они назвали новую технологию CRISPR-LICHT и опубликовали результаты в журнале Science.
Используя церебральные органоиды — трёхмерную клеточную модель человеческого мозга, разработанную в группе Юргена Кноблиха в IMBA, — теперь можно анализировать роль сотен мутаций в мозге человека с помощью CRISPR-LICHT.
«Основой метода является комбинация хорошо известной технологии CRISPR-Cas9, отмеченной Нобелевской премией в октябре 2020 года, и метода двойного штрихкодирования», — объясняет соавтор Доминик Линденхофер, аспирант IMBA. «Ключевым приёмом было применение не только гидовой РНК (guide RNA), но и генетического штрихкода — фрагмента ДНК, который мы добавляем в геном клеток, используемых для выращивания органоидов. Это позволяет нам видеть всю клеточную линию каждого органоида, а второй штрихкод даёт возможность подсчитать количество клеток, произведённых каждой исходной клеткой. Это снижает шум, и мы можем определить влияние каждой гидовой РНК на количество клеток, произведённых во время роста органоида. Мы назвали наш подход CRISPR-Lineage Tracing at Cellular resolution in Heterogenous Tissue (CRISPR-LICHT)».
Исследователи применили CRISPR-LICHT для изучения микроцефалии — генетического нарушения, вызываемого уменьшением размера мозга и тяжёлыми умственными расстройствами у пациентов. С помощью этой революционной технологии учёные провели скрининг всех генов, подозреваемых в причастности к болезни.
«Мы не только смогли идентифицировать гены микроцефалии с помощью CRISPR-LICHT, но и определили конкретный механизм, участвующий в контроле размера мозга», — говорит постдок IMBA и соавтор Кристофер Эск. Было установлено, что эндоплазматический ретикулум (ЭПР) является главным узлом, контролирующим секрецию белков внеклеточного матрикса. Этот механизм влияет на целостность ткани и, следовательно, на размер мозга, и был определён как одна из причин микроцефалии.
«Мы очень рады сообщить, что теперь можем рутинно проводить генетические скрининги в сложных органоидных системах. Метод может быть применён к другим моделям органоидов и к любым заболеваниям, влияющим на формирование органов. Это совершенно новый подход к анализу нарушений мозга, и он обладает невероятным будущим потенциалом, так как может быть применён к любым заболеваниям мозга, включая аутизм», — говорит Юрген Кноблих, последний автор исследования.