Новый метод Repair-seq улучшает CRISPR-редактирование генома
Возможность редактировать геном, изменяя последовательность ДНК в живой клетке, крайне важна для исследований и обещает прорыв в лечении болезней. Однако существующие технологии часто приводят к нежелательным мутациям или вообще не вносят изменений, что ограничивает их потенциал.
Новое исследование лаборатории Бритт Адамсон (Принстонский университет) совместно с коллегами из лаборатории Джонатана Вайсмана (Институт Уайтхеда, MIT, Медицинский институт Говарда Хьюза) и Сесилии Котта-Рамузино (ранее — Editas Medicine) представляет метод Repair-seq. Он детально показывает, как работают инструменты редактирования генома.
«Мы давно знаем, что механизмы репарации (починки) разрывов ДНК важны для редактирования генома, ведь чтобы изменить последовательность ДНК, её сначала нужно разорвать. Но эти процессы невероятно сложны и их трудно изучать», — поясняет Бритт Адамсон.
Клетки используют множество механизмов репарации ДНК, каждый из которых задействует наборы генов в различных путях. Repair-seq позволяет оценить вклад этих путей в восстановление конкретных повреждений ДНК, одновременно анализируя влияние сотен отдельных генов на мутации в местах разрывов. Это позволяет строить модели репарации ДНК и понимать, как они влияют на редактирование генома.
Исследователи применили свой метод к популярному подходу CRISPR-Cas9. Система использует нуклеазу Cas9 для создания двуцепочечных разрывов ДНК.
«Редактирование с помощью двуцепочечных разрывов — основа технологии, но внесение нужных изменений без нежелательных мутаций остаётся огромной проблемой», — отмечает первый автор исследования Джеффри Хуссманн.
Анализ огромного массива данных Repair-seq, проведённый Хуссманном, создал карту связи различных путей репарации ДНК с определёнными типами мутаций, индуцированных Cas9. Работа подтвердила известные пути и выявила новые, подчеркнув сложность систем починки двуцепочечных разрывов. Полный набор данных теперь доступен в онлайн-портале для изучения генов и путей репарации.
Отдельно команда Дэвида Лю (Broad Institute) разработала систему «прайм-редактирования» (prime editing), которая не создаёт двуцепочечных разрывов. Её эффективность сильно варьирует в зависимости от типа клеток и мишени. Учёные предположили, что идентификация задействованных путей репарации поможет найти способы улучшения.
Объединив усилия, Адамсон, Хуссманн и Лю с коллегами применили Repair-seq к прайм-редактированию. Они обнаружили, что на результат прайм-редактирования влияют белки пути репарации ошибочно спаренных нуклеотидов (mismatch repair). Подавление или обход этого пути значительно повысили эффективность и точность прайм-редактирования, что расширяет возможности этой технологии.
«Это прекрасный пример интеграции фундаментальной науки, применения инструментов и разработки технологий — настоящая демонстрация силы междисциплинарного сотрудничества», — сказал Дэвид Лю.
Важно, что Repair-seq можно использовать для улучшения и других технологий редактирования генома. Исследователи уже применили его к третьей системе, также разработанной в лаборатории Лю. Результаты этой работы опубликованы в Nature Biotechnology.
«Repair-seq — это прекрасный союз технологической смекалки и биологического понимания», — отметил Джон Денч (Broad Institute), не участвовавший в работе.
В будущем команда планирует совершенствовать платформу и применять её к новым технологиям редактирования генома.
«Мы видим Repair-seq как инструмент, который позволяет сделать детальный снимок того, что редакторы генома делают внутри клеток, и быстро оценить, можно ли в этой картине найти принципы для улучшения инструмента», — говорит Бритт Адамсон.
Исследования поддержаны грантами Национальных институтов здоровья (NIH), Медицинского института Говарда Хьюза (HHMI), программы Searle Scholars, Национального научного фонда (NSF), Фонда исследования рака Деймона Раньона, Совета по стипендиям Китая и Национального института рака.