Ученые определили структуру ключевого белкового комплекса ДНК с почти атомарным разрешением
Исследователи из Национальной лаборатории Лоуренса в Беркли (Berkeley Lab) Министерства энергетики США получили самую детальную на сегодняшний день карту крупного комплекса человеческих белков, критически важного для функционирования ДНК. Достижение стало еще одним успехом новой технологии визуализации — криоэлектронной микроскопии (cryo-EM), которая революционизирует структурную биологию.
Ученые сообщили о своем достижении 13 сентября в журнале Nature. С помощью cryo-EM они определили трехмерную структуру белкового комплекса, называемого фактором транскрипции IIH (TFIIH), с разрешением 4.4 ангстрема, что близко к атомарному уровню. Этот комплекс используется для разделения цепей двойной спирали ДНК, чтобы обеспечить доступ к генам и их считывание во время транскрипции или репарации (починки).
"Когда TFIIH работает неправильно, репарация ДНК не происходит. Эта неисправность связана с тяжелой предрасположенностью к раку, преждевременным старением и рядом других дефектов", — сказала руководитель исследования Ева Ногалес, научный сотрудник отдела молекулярной биофизики и интегративной биоимиджинги Berkeley Lab. — "Используя эту структуру, мы теперь можем начать анализировать мутации в контексте, чтобы лучше понять, почему они вызывают неправильное поведение в клетках".
Критическая роль TFIIH в функционировании ДНК давно делает его важной мишенью для исследований, но он считается сложным для изучения комплексом, особенно у человека.
Для картирования комплекса потребовалась передовая технология
"По мере усложнения организмов эти белки также усложняются, приобретая дополнительные элементы, необходимые для регуляторных функций на многих уровнях", — отметила Ногалес. — "Тот факт, что мы определили структуру этого белка из человеческих клеток, делает это исследование еще более актуальным для изучения болезней. Нет необходимости экстраполировать функцию белка на основе того, как он работает у других организмов".
Биомолекулы, такие как белки, обычно визуализируют с помощью рентгеновской кристаллографии, но этот метод требует большого количества стабильного образца для кристаллизации. Проблема с TFIIH заключается в том, что его трудно производить и очищать в достаточных количествах, а полученный образец может не образовывать кристаллы, пригодные для рентгеновской дифракции.
На помощь пришла cryo-EM, которая может работать даже с очень небольшими количествами образца. Электроны пропускают через очищенные образцы, мгновенно замороженные при сверхнизких температурах, чтобы предотвратить образование кристаллического льда.
Cryo-EM существует десятилетиями, но крупные достижения за последние пять лет привели к скачку в качестве высокодетальных изображений, достижимых с помощью этой техники.
"Когда ваша цель — добиться разрешения в несколько ангстрем, проблема в том, что любое движение увеличивается", — пояснил ведущий автор исследования Базил Гребер, постдокторант Калифорнийского университета в Беркли. — "При сильном увеличении легкое движение образца при прохождении электронов приводит к размытому изображению".
От одиночных снимков к "кино"
Исследователи связывают взрывной рост возможностей cryo-EM с развитием технологии детекторов, в создании которой участвовал инженер Berkeley Lab Питер Денес. Вместо одного снимка на образец камера прямого детектирования делает несколько кадров, что похоже на запись видео. Затем кадры объединяются для создания высокодетального изображения. Этот подход устраняет размытие от движения образца. Улучшенные изображения содержат данные более высокого качества и позволяют изучать образец в различных состояниях, в которых он существует в клетке.
Поскольку съемка "видео" генерирует гораздо больше данных, чем один кадр, и за сеанс микроскопии собираются тысячи таких записей, исследователям потребовалась вычислительная мощность суперкомпьютеров Национального центра научных вычислений для исследований в области энергетики (NERSC) в Berkeley Lab. Результатом этих вычислений стала 3D-карта, требующая дальнейшей интерпретации.
"Когда мы начали обработку данных, у нас было 1.5 миллиона изображений отдельных молекул для сортировки", — сказал Гребер. — "Нам нужно было выбрать частицы, представляющие собой интактный комплекс. После 300 000 CPU-часов работы на NERSC у нас осталось 120 000 изображений отдельных частиц, которые были использованы для вычисления 3D-карты белка".
Чтобы получить атомную модель белкового комплекса на основе этой 3D-карты, исследователи использовали программное обеспечение PHENIX (Python-based Hierarchical ENvironment for Integrated Xtallography), разработку которого возглавляет Пол Адамс, директор отдела молекулярной биофизики и интегративной биоимиджинги Berkeley Lab и соавтор данного исследования.
Эта структура не только помогает в фундаментальном понимании репарации ДНК, но и может быть использована для визуализации того, как специфические молекулы связываются с белками-мишенями при разработке лекарств.
"Изучая физику и химию этих биологических молекул, мы часто можем определить, что они делают, но как они это делают, остается неясным", — заключила Ногалес. — "Эта работа — яркий пример того, чем занимаются структурные биологи. Мы создаем основу для понимания того, как функционируют молекулы. И с этой информацией исследователи могут разрабатывать точно направленные терапии с большей предсказательной силой".